【化工儀器網(wǎng) 科技前沿】拉曼激活細(xì)胞彈射耦合測序(RACE-Seq)是微生物組單細(xì)胞分析的手段之一，但其基因組覆蓋度通常不超過10%，而且核酸擴(kuò)增成功率低，極大限制了其應(yīng)用。中國科學(xué)院青島生物能源與過程研究所單細(xì)胞中心系統(tǒng)評估和優(yōu)化了該技術(shù)，并改進(jìn)了單細(xì)胞基因組擴(kuò)增環(huán)節(jié)，從而提高了RACE-Seq的基因組覆蓋度和核酸擴(kuò)增成功率。該工作近日發(fā)表于Analytical Chemistry。
 

　　作為微生物在自然界中的存在形式，微生物組(菌群；Microbiome)與人體和自然界的過去、現(xiàn)在和未來息息相關(guān)。但是，菌群中絕大部分微生物組分通常難以快速培養(yǎng)和利用，因此，微生物組又被稱為"生命暗物質(zhì)”。如何識別和利用"生命暗物質(zhì)”中的功能組分，一直是生命科學(xué)和環(huán)境科學(xué)中的一個共性方法學(xué)問題。
 

　　針對這個瓶頸，單細(xì)胞中心和業(yè)界同行前期發(fā)明了一系列單細(xì)胞拉曼分選技術(shù)與裝備(RACS-Seq; Biotechnol Adv, 2019; doi: 10.1016/j.biotechadv.2019.04.010)。RACS-Seq技術(shù)家族的工作原理均為，基于單細(xì)胞拉曼光譜來從菌群樣品中直接識別和分選特定代謝功能的細(xì)胞，進(jìn)而與核酸提取、擴(kuò)增和測序?qū)?，從而深刻理解菌群?誰在做什么？如何做？”。其中的RACE-Seq技術(shù)將菌群細(xì)胞風(fēng)干后、在彈射芯片表面平鋪成單層，逐一采集拉曼光譜后，采用另一束激光將目標(biāo)拉曼光譜的細(xì)胞從芯片表面彈射到接收芯片的小孔中，進(jìn)而在小孔中進(jìn)行核酸擴(kuò)增和測序文庫制備。但是，在已發(fā)表的RACE-Seq應(yīng)用于人體或菌群分析的工作中，單細(xì)胞基因組測序的覆蓋度普遍很低(很少超過20%，大多在10%以下)，同時其完整流程的成功率也不高，以致于通常需要把幾個乃至幾十個細(xì)胞彈射至同一個小孔中，混合進(jìn)行基因組擴(kuò)增和測序，以提高實驗的成功率。這種低覆蓋度而且混合測定的單細(xì)胞基因組數(shù)據(jù)，從根本上阻礙了在細(xì)胞"個體”水平的基因組結(jié)構(gòu)分析與代謝功能重建。
 

　　為了揭示RACE-Seq基因組覆蓋率極低的原因，單細(xì)胞中心蘇曉璐與公衍海帶領(lǐng)的研究小組，基于長期努力，從實驗操作和數(shù)據(jù)計算分析兩個角度入手，建立了系統(tǒng)性的RACE-Seq方法和芯片的質(zhì)量評估和控制體系。在此基礎(chǔ)上，全面、定量地評估了細(xì)胞裂解條件、核酸擴(kuò)增條件和拉曼測量條件等每一環(huán)節(jié)的關(guān)鍵參數(shù)對RACE-Seq基因組測序質(zhì)量的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，激光照射強(qiáng)度在拉曼信號采集過程中至關(guān)重要，并與單細(xì)胞核酸擴(kuò)增(MDA)的成功率成反比。
 

　　針對這些問題，研究人員開發(fā)出了二代RACE-Seq(圖1):在單細(xì)胞擴(kuò)增體系中加入特定油相并充分震蕩，產(chǎn)生大量隨機(jī)包裹的微體積液滴，造成每個DNA片段在破乳前均達(dá)到飽和擴(kuò)增，從而大幅提高RACE-Seq中單細(xì)胞基因組的覆蓋度。這種操作方法簡單快速，而且容易實現(xiàn)自動化。
 

　　與第一代RACE-Seq相比，該二代技術(shù)可將純培養(yǎng)大腸桿菌(每個MDA體系含5個彈射出的細(xì)胞)單細(xì)胞基因組覆蓋度從 < 20% 提高到50%。針對土壤菌群樣品的測試表明(每個MDA體系含2~5個彈射出的細(xì)胞)，二代技術(shù)可將MDA反應(yīng)的成功率從58%提高到 90%，而將MDA產(chǎn)物16S擴(kuò)增成功率從0%大幅提升至83%?；谶@些優(yōu)點(diǎn)，單細(xì)胞中心開發(fā)了RACE-Seq試劑盒(圖2)，以服務(wù)于各種環(huán)境樣品和應(yīng)用場景。
 

　　盡管如此，由于拉曼全譜采集對于細(xì)胞活性的破壞，RACE-Seq目前還難以實現(xiàn)在"一個”細(xì)菌細(xì)胞水平的高覆蓋度基因組測序或細(xì)胞培養(yǎng)。針對這些局限性，研究人員正在開發(fā)一系列液相拉曼分選耦合測序器件，以建立與完善一個高拉曼全譜信號質(zhì)量、高基因組測序覆蓋度、高效保護(hù)細(xì)胞活性、一個細(xì)菌細(xì)胞精度的微生物組分析技術(shù)服務(wù)體系。
 

　　蘇曉璐和公衍海是論文的共同第一作者。該工作得到中科院先導(dǎo)B項目、青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點(diǎn)國家實驗室、國家自然科學(xué)基金等的支持。