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化工儀器網(wǎng)>產(chǎn)品展廳>生命科學(xué)儀器>分子生物學(xué)儀器>其它生物/生化分析儀> 目的基因亞克隆

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上?;偕锟萍加邢薰境闪⒂?013年6月,位于上海周浦時代醫(yī)創(chuàng)園,是一家銳意進取的生物高科技創(chuàng)新型企業(yè),集生物技術(shù)研發(fā)、支持和服務(wù)為一體,為生命科學(xué)領(lǐng)域的科研人員,臨床醫(yī)學(xué)人員等提供TA克隆,亞克隆,質(zhì)粒構(gòu)建,RNAi干擾,miRNA定量,熒光定量PCR,SNP分型,STR檢測,基因編輯,基因敲除,動物造模等相關(guān)的技術(shù)服務(wù)的同時,我們也在不斷摸索,積極研發(fā)自己的試劑產(chǎn)品,如分子,蛋白,細胞等方面的常規(guī)試劑,提供給我們的敬愛的科研工作者,并且我們與國內(nèi)外具有競爭力的耗材儀器廠家達成協(xié)議,保持長期穩(wěn)定的合作,秉承在技術(shù)方面提供支持的同時,也同樣提供國內(nèi)外優(yōu)質(zhì)的試劑,耗材,常規(guī)儀器、分析儀器,滿足客戶的不同需求,一站式的服務(wù)是我們經(jīng)營的理念,我們將不斷提高技術(shù)人員的技術(shù)水平,銷售人員的業(yè)務(wù)能力,圓滿完成技術(shù)服務(wù)項目及產(chǎn)品銷售,同時,并為廣大的科研工作者提供可靠的產(chǎn)品和全面的技術(shù)服務(wù),用我們過硬的技術(shù),優(yōu)質(zhì)的產(chǎn)品,完善的服務(wù)獲得每個客戶信任,支持和厚愛,最后感謝各位的支持和幫助。
公司技術(shù)平臺特色:
分子生物學(xué)技術(shù)服務(wù)項目包括
TA克隆,亞克隆;質(zhì)粒構(gòu)建,熒光定量PCR檢測;RNAi干擾;miRNA檢測;SNP分型;STR檢測等;文庫構(gòu)建;高通量測序。

蛋白組學(xué)技術(shù)服務(wù)項目包括:
蛋白抽提,蛋白純化,WB,Elisa,免疫組化,質(zhì)譜鑒定,N端測序等。

細胞生物學(xué)技術(shù)服務(wù)項目包括:
細胞培養(yǎng),細胞轉(zhuǎn)染;慢病毒包裝;腺病毒包裝; 基因編輯;基因敲除;動物造模等;

代理銷售產(chǎn)品:

儀器類:移液器:Eppendorf移液器、吉爾森移液器,銳寧移液器,大龍移液器,寶予德移液器

離心機:Eppendorf離心機,盧湘儀離心機,蜀科離心機,安亭離心機,ABSON迷你離心機

PCR儀:賽洛捷克PCR儀,ABI普通PCR儀、ABI 7500/ 7500Fast實時定量PCR儀

Bio-rad產(chǎn)品:凝膠成像系統(tǒng)、Bio-rad電源,Bio-rad電泳槽、Bio-rad轉(zhuǎn)移槽,玻璃板

箱體產(chǎn)品:一恒培養(yǎng)箱、一恒干燥箱,一恒恒溫搖床,安泰超凈臺,中科美菱超低溫冰箱

試劑類:

gegenetech醫(yī)藥中間體全線產(chǎn)品:總代理

Abbkine全線產(chǎn)品:上海區(qū)域一級代理

MCE小分子抑制劑,激動劑全線產(chǎn)品:上海區(qū)域一級代理

Bioteke核酸提取及分子試劑全線產(chǎn)品:上海區(qū)域一級代理

Thermo scientific部分產(chǎn)品:上海區(qū)域特約經(jīng)銷商

NEB全線產(chǎn)品:上海區(qū)域特約經(jīng)銷商

耗材類:

Axygen全線產(chǎn)品:全國特約經(jīng)銷商

Corning全線產(chǎn)品:全國特約經(jīng)銷商

BD 耗材產(chǎn)品:上海區(qū)域特約經(jīng)銷商

NEST耗材產(chǎn)品:上海區(qū)域特約經(jīng)銷商








分子,蛋白及細胞技術(shù)服務(wù),生物儀器,生物試劑,生物耗材

亞克隆

已經(jīng)獲得的目的DNA條帶進行重新克隆,其目的在于對目的DNA進行進一步分析,或者進行重組改造等。

亞克隆的基本過程包括:

(1)目的DNA條帶和載體的制備;(2)目的DNA條帶和載體的連接;(3)連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化;(4)重組子篩選。

目的DNA條帶和載體的制備
    選擇適宜的限制性核酸內(nèi)切酶,消化已知目的DNA和載體,獲得線性DNA,用于重組。根據(jù)目的DNA和載體的具體情況,選擇一種或者兩種適當(dāng)?shù)南拗泼盖懈?,分別產(chǎn)生對稱性粘性末端(用一種限制性內(nèi)切酶進行消化而產(chǎn)生帶有互補突出端)、不對稱粘性末端(用兩種不同的限制性內(nèi)切酶進行消化而產(chǎn)生帶有非互補突出端)、平端。在亞克隆時,*不對稱相容末端連接,次選對稱性粘性相容性末端連接,由于平末端連接效率較低,通常很少采用。但有時目的片段的末端與載體不匹配 ,一般先將不匹配末端補平,然后再以平末端連接。

利用T4 DNA連接酶進行目的DNA條帶和載體的體外連接

外源DNA條帶末端性質(zhì)

連接要求

          連接結(jié)果

不對稱粘性末端

兩種限制酶消化后,需純化載體以提高連接效率

載體與外源DNA連接處的限制酶切位點常可保留;非重組克隆的背景較低;外源DNA可以定向插入到載體中。

對稱性粘性末端

線形載體DNA常需磷酸酶脫磷處理

載體與外源DNA連接處的限制酶切位點常可保留;重組質(zhì)粒會帶有外源DNA的串聯(lián)拷貝;外源DNA會以兩個方向插入到載體中。

平端

要求高濃度的DNA和連接酶

載體與外源DNA連接處的限制酶切位點消失;重組質(zhì)粒會帶有外源DNA的串聯(lián)拷貝;非重組克隆的背景較高 。

連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化
⑴ 取100μl貯存于-70℃鈣化菌,冰浴化開;
⑵ 加入適量連接產(chǎn)物(一般不超過10μl,輕輕混勻,冰浴20min;
⑶ 于42℃熱休克90s,迅速轉(zhuǎn)移至冰浴中,繼續(xù)冰浴2-3min;
⑷ 加入LB液體培養(yǎng)基200μl,于37℃緩搖孵育45min;
⑸ 將培養(yǎng)物適量涂于1.5%瓊脂LB平板(根據(jù)質(zhì)粒性質(zhì)添加抗生素或/和X-Gal/IPTG),待膠表面沒有液體流動時,37℃溫箱倒置培養(yǎng)12-16hr。

重組子的篩選
   根據(jù)載體的遺傳特征篩選重組子,如α-互補、抗生素基因等?,F(xiàn)在使用的許多載體都帶有一個大腸桿菌的DNA的短區(qū)段,其中有β-半乳糖苷酶基因(lacZ)的調(diào)控序列和前146個氨基酸的編碼信息。在這個編碼區(qū)中插入了一個多克隆位點(MCS),它并不破壞讀框,但可使少數(shù)幾個氨基酸插入到β-半乳糖苷酶的氨基端而不影響功能,這種載體適用于可編碼β-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主細胞。因此,宿主和質(zhì)粒編碼的片段雖都沒有酶活性,但它們同時存在時,可形成具有酶學(xué)活性的蛋白質(zhì)。這樣,lacZ基因在缺少近操縱基因區(qū)段的宿主細胞與帶有完整近操縱基因區(qū)段的質(zhì)粒之間實現(xiàn)了互補,稱為α-互補。由α-互補而產(chǎn)生的LacZ 細菌在誘導(dǎo)劑IPTG的作用下,在生色底物X-Gal存在時產(chǎn)生藍色菌落,因而易于識別。然而,當(dāng)外源DNA插入到質(zhì)粒的多克隆位點后,幾乎不可避免地導(dǎo)致無α-互補能力的氨基端片段,使得帶有重組質(zhì)粒的細菌形成白色菌落。這種重組子的篩選,又稱為藍白斑篩選。如用藍白斑篩選則經(jīng)連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化的鈣化菌平板37℃溫箱倒置培養(yǎng)12-16hr后,有重組質(zhì)粒的細菌形成白色菌落。

 

 

 

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