BY-1426 PK15-B1豬腎傳代細(xì)胞系

病毒受體高表達(dá)：高表達(dá)豬圓環(huán)病毒受體硫酸乙酰肝素（陽(yáng)性率 98%）和豬細(xì)小病毒受體整合素 αvβ3（陽(yáng)性率 96%），其硫酸乙酰肝素表達(dá)量是母系 PK15 細(xì)胞的 2.5 倍，整合素 αvβ3 表達(dá)量提升 40%，為病毒高效吸附與入侵提供分子基礎(chǔ)；同時(shí)上皮特異性標(biāo)志物細(xì)胞角蛋白 18（CK18）陽(yáng)性率保持 97%，確保上皮功能完整性。

病毒復(fù)制支持能力：對(duì)豬圓環(huán)病毒 2 型的感染效率達(dá) 99%（母系 PK15 細(xì)胞為 65%），病毒復(fù)制周期縮短 12 小時(shí)，48 小時(shí)即可達(dá)到母系 72 小時(shí)的病毒滴度（10? TCID??/mL）；對(duì)豬細(xì)小病毒的支持能力也顯著提升，核內(nèi)包涵體形成率達(dá) 85%，較母系提高 30%，體現(xiàn)對(duì) DNA 病毒的廣譜高敏感性。

遺傳穩(wěn)定性：全基因組測(cè)序顯示，PK15-B1 與母系 PK15 細(xì)胞的序列一致性達(dá) 99.8%，僅在 3 個(gè)病毒受體相關(guān)基因啟動(dòng)子區(qū)域存在甲基化差異，導(dǎo)致受體表達(dá)上調(diào)，確保遺傳背景穩(wěn)定的同時(shí)實(shí)現(xiàn)功能優(yōu)化。

病毒分離與鑒定：作為豬圓環(huán)病毒分離的 “金標(biāo)準(zhǔn)” 細(xì)胞系，PK15-B1 從臨床樣本中的病毒分離率達(dá) 95%（母系 PK15 細(xì)胞僅 60%），且能在 3 天內(nèi)觀察到典型細(xì)胞病變（胞質(zhì)內(nèi)綠色熒光包涵體），顯著縮短診斷周期。我國(guó)首ci分離的豬圓環(huán)病毒 3 型即依賴(lài)該細(xì)胞系完成純化鑒定。

病毒復(fù)制機(jī)制解析：利用其高敏感性，發(fā)現(xiàn)豬圓環(huán)病毒 2 型衣殼蛋白（Cap）與硫酸乙酰肝素的結(jié)合親和力較母系細(xì)胞提升 2 倍，且病毒在該細(xì)胞內(nèi)的 DNA 復(fù)制效率提高 40%，為解析病毒復(fù)制調(diào)控機(jī)制提供關(guān)鍵證據(jù)。

疫苗生產(chǎn)效能提升：在豬圓環(huán)病毒滅活疫苗生產(chǎn)中，PK15-B1 細(xì)胞的病毒產(chǎn)量達(dá) 10?.? PFU/mL，較母系 PK15 細(xì)胞提升 60%，單位體積培養(yǎng)基的病毒收獲量增加 45%，顯著降低生產(chǎn)成本；疫苗免疫仔豬后，中和抗體效價(jià)達(dá) 1:256，較母系細(xì)胞生產(chǎn)的疫苗提升 30%。

疫苗效力快速評(píng)價(jià)：作為疫苗批簽發(fā)的標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)細(xì)胞系，其病毒中和試驗(yàn)結(jié)果與仔豬攻毒保護(hù)率的一致性達(dá) 92%，較母系細(xì)胞提升 15%，且檢測(cè)時(shí)間縮短 24 小時(shí)，被農(nóng)業(yè)部列為豬圓環(huán)病毒疫苗效力檢測(cè)的shou選細(xì)胞系。

藥物篩選模型：基于其高效病毒復(fù)制能力，建立自動(dòng)化高通量篩選體系，日均可檢測(cè) 300 種化合物。篩選出的新型圓環(huán)病毒抑制劑可使病毒滴度下降 1000 倍，EC??值較母系細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果降低 40%，顯著提升篩選靈敏度。

作用機(jī)制研究：利用該細(xì)胞系發(fā)現(xiàn)某植物提取物可特異性抑制病毒 Cap 蛋白與硫酸乙酰肝素的結(jié)合，阻斷率達(dá) 85%，為靶向受體的抗病du藥物開(kāi)發(fā)提供新方向。

培養(yǎng)基：MEM 培養(yǎng)基添加 10% 胎牛血清、1% 非必需氨基酸，pH 維持在 7.2-7.4；為增強(qiáng)病毒復(fù)制能力，可添加 5ng/mL 表皮生長(zhǎng)因子（EGF），使病毒受體表達(dá)量再提升 20%。大規(guī)模生產(chǎn)可采用無(wú)血清培養(yǎng)基，病毒產(chǎn)量與含血清體系相當(dāng)。

傳代流程：當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá) 70% 時(shí)，消化處理后按 1:5 比例接種，離心速度 1000rpm，24 小時(shí)貼壁率超 95%，避免過(guò)度融合（＞80% 會(huì)導(dǎo)致病毒敏感性下降）。

凍存保護(hù)：采用含 10% DMSO 的wan全培養(yǎng)基，細(xì)胞密度 2×10?個(gè) /mL，程序降溫至 - 80℃過(guò)夜后轉(zhuǎn)入液氮，復(fù)蘇時(shí) 37℃水浴 1 分鐘，接種至預(yù)涂明膠的培養(yǎng)瓶，存活率可達(dá) 92%。

豬圓環(huán)病毒培養(yǎng)優(yōu)化：細(xì)胞以 2×10?個(gè) / 孔接種 24 孔板，培養(yǎng) 24 小時(shí)后換含 2% 血清的維持液，加入病毒液（MOI=0.01），37℃吸附 1 小時(shí)后換液，48 小時(shí)后通過(guò)間接免疫熒光檢測(cè)病毒 Cap 蛋白，陽(yáng)性率可達(dá) 98%，結(jié)果變異系數(shù)＜5%。

病毒滴度測(cè)定：采用 TCID??法，將病毒液 10 倍系列稀釋后接種 PK15-B1 細(xì)胞，72 小時(shí)觀察細(xì)胞病變，其終點(diǎn)稀釋度較母系 PK15 細(xì)胞高 2 個(gè)數(shù)量級(jí)，檢測(cè)靈敏度顯著提升。

優(yōu)勢(shì)：

局限性：