ONT 細(xì)菌全基因組甲基化納米孔測(cè)序

表觀修飾不需要改變DNA序列便能實(shí)現(xiàn)對(duì)性狀的改變，表觀修飾的改變與基因功能乃至細(xì)胞狀態(tài)、發(fā)育、衰老、疾病等存在重要的關(guān)聯(lián)。在眾多的表觀遺傳修飾中，是為重要且研究廣泛的修飾之一是DNA甲基化。

由于PCR的擴(kuò)增過(guò)程會(huì)消除堿基修飾信息，通過(guò)傳統(tǒng)測(cè)序技術(shù)對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)需要使用特殊的文庫(kù)制備步驟，從而造成核酸損壞，最終導(dǎo)致測(cè)序讀長(zhǎng)序列非常短。

Nanopore測(cè)序是Oxford Nanopore Technologies(ONT)公司開發(fā)的基于納米孔電信號(hào)的單分子實(shí)時(shí)測(cè)序技術(shù)，DNA雙鏈在馬達(dá)蛋白的作用下與錨定在生物膜上的八聚體納米孔蛋白結(jié)合并解螺旋。由于生物膜兩測(cè)存在電勢(shì)差，解旋后的單鏈DNA以一定速率通過(guò)納米孔。由于化學(xué)性質(zhì)不同，不同堿基通過(guò)納米孔時(shí)，會(huì)引起不同電信號(hào)的變化。通過(guò)對(duì)這些電信號(hào)變化進(jìn)行檢測(cè)和解析，完成序列的實(shí)時(shí)測(cè)定。Nanopore的堿基判讀是依據(jù)其電流信號(hào)而產(chǎn)生，因此其判定過(guò)程比較復(fù)雜。目前Nanopore根據(jù)電流的大小及電流大小的變化情況，通過(guò)“遞歸神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（Recurrent Neural Network）”的復(fù)雜算法對(duì)堿基進(jìn)行判讀。

ONT全基因組甲基化測(cè)序原理示意圖如下：

技術(shù)優(yōu)勢(shì)：

?  長(zhǎng)讀長(zhǎng)：平均讀長(zhǎng)＞10Kbp，長(zhǎng)可達(dá)2M左右，直接跨越重復(fù)序列、高度多態(tài)性區(qū)域等特殊區(qū)域；

?  直接測(cè)序：無(wú)需PCR擴(kuò)增，可直接保留并檢測(cè)DNA甲基化修飾；

?  全基因組覆蓋：可同時(shí)檢測(cè)全基因組范圍單堿基的5mC與6mA修飾位點(diǎn)，并給出單堿基的甲基化水平；

?  性價(jià)比高：ONT測(cè)序成本相對(duì)于二代NGS測(cè)序技術(shù)大幅降低。

實(shí)驗(yàn)策略：

分析內(nèi)容：

注：個(gè)性化分析、多組學(xué)關(guān)聯(lián)分析請(qǐng)聯(lián)系對(duì)接銷售或技術(shù)支持

送樣要求：

不同DNA甲基化測(cè)序技術(shù)比較：

經(jīng)典案例

Engineering selectivity of Cutibacterium acnes phages by epigenetic imprinting

通過(guò)表觀遺傳印跡研究痤瘡桿菌(C.acnes)噬菌體的選擇

①  背景

痤瘡桿菌（C.acnes）是一種革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，是人類皮膚微生物組成員。盡管是豐富的皮膚共生體，但某些成員與常見的炎癥性疾病（如痤瘡）有關(guān)。各種C.acnes分支的完整基因組序列可以鑒定推定的甲基轉(zhuǎn)移酶，其中一些可能屬于保護(hù)入侵DNA宿主的限制性修飾（R-M）系統(tǒng)。然而，關(guān)于這些系統(tǒng)是否在不同的C.acnes菌株中起作用，目前知之甚少。

②  方法

通過(guò)Oxford Nanopore Technologies（ONT）測(cè)序分析了六種代表性痤瘡C.acnes菌株的甲基化水平。

③  結(jié)論

在菌株KPA171202中確定的DNA共有序列上檢測(cè)到6mA修飾，且該R-M系統(tǒng)的重組表達(dá)證實(shí)了其甲基化活性，而R-M敲除突變體驗(yàn)證了該菌株甲基化特性的缺失。此外還研究了C. acnes噬菌體（PAD20）殺死各種C. acnes菌株的潛力，并將其特異性的增加與甲基化敏感株獲得的噬菌體DNA甲基化聯(lián)系起來(lái)。研究證明R-M缺失菌株中繁殖的噬菌體選擇性地殺死R-M缺失痤瘡敏感分支，而益生菌保持對(duì)噬菌體感染的抗性。

ONT測(cè)序揭示C. acnes KPA171202的R-M系統(tǒng)IIIB影響PAD20噬菌體感染特性并保護(hù)細(xì)菌免于裂解。

參考文獻(xiàn)：

①   Kn?dlseder N, et al. Engineering selectivity of Cutibacterium acnes phages by epigenetic imprinting. PLoS Pathog. 2022 Mar;18(3):e1010420.

②   Gouil Q, Keniry A. Latest techniques to study DNA methylation. Essays Biochem. 2019 Dec 20;63(6):639-648.