質(zhì)粒轉(zhuǎn)染

1）技術(shù)原理:

轉(zhuǎn)染類型：根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，外?/span>DNA導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞又可分為瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染。

瞬時(shí)轉(zhuǎn)染一般是指外源基因進(jìn)入受體細(xì)胞后，存在于游離的載體上，不整合到染色體，在外源DNA導(dǎo)入細(xì)胞1—4天后收獲轉(zhuǎn)染細(xì)胞對轉(zhuǎn)染基因的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制進(jìn)行分析。

而穩(wěn)定轉(zhuǎn)染則需要使外源基因整合于細(xì)胞染色體從而得到穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染細(xì)胞株。實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，通常需要一個(gè)抗生素篩選的過程。

除DEAE葡聚糖只能用于瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，其他方法均可用于瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染。

質(zhì)粒轉(zhuǎn)染是指將外源分子如DNA，RNA等導(dǎo)入真核細(xì)胞的技術(shù)。隨著分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)研究的不斷發(fā)展，轉(zhuǎn)染已經(jīng)成為研究和控制真核細(xì)胞基因功能的常規(guī)工具。在研究基因功能、調(diào)控基因表達(dá)、突變分析和蛋白質(zhì)生產(chǎn)等生物學(xué)試驗(yàn)中，其應(yīng)用越來越廣泛。

因?yàn)椴煌募?xì)胞在生理代謝及分裂上均存在差異，因此研究者將外源遺傳物質(zhì)導(dǎo)入細(xì)胞的過程中需要選擇不同的方式。目前，將外源物質(zhì)導(dǎo)入細(xì)胞的方法主要分為三大類：1、脂質(zhì)體（或是脂質(zhì)體替代物）轉(zhuǎn)染；2、電轉(zhuǎn)；3、病毒感染。這三種方法互有優(yōu)劣。脂質(zhì)體或是脂質(zhì)體替代物轉(zhuǎn)染操作簡便，價(jià)格低廉，但是對細(xì)胞毒性大。而且，有些細(xì)胞通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染效率很低；電轉(zhuǎn)操作方便快捷，但是需要專門的儀器，對細(xì)胞損傷也比較大；病毒感染克服了前兩者的劣勢，感染效率高，對細(xì)胞毒性小，但是病毒前期包裝需要大量的時(shí)間和精力 。

備注：不含細(xì)胞株、轉(zhuǎn)染試劑。

2）質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的詳細(xì)介紹

脂質(zhì)體：中性脂質(zhì)(lipid)是利用脂質(zhì)膜包裹DNA，借助脂質(zhì)膜將DNA導(dǎo)入細(xì)胞膜內(nèi)。帶正電陽離子脂質(zhì)體(Cationic liposomes)則不同，DNA并沒有預(yù)先包埋在脂質(zhì)體中，而是帶負(fù)電的DNA自動(dòng)結(jié)合到帶正電的脂質(zhì)體上，形成DNA-陽離子脂質(zhì)體復(fù)合物，據(jù)認(rèn)為一個(gè)約5kb的質(zhì)粒會(huì)結(jié)合2-4個(gè)陽離子脂質(zhì)體，從而吸附到帶負(fù)電的細(xì)胞膜表面，經(jīng)過內(nèi)吞被導(dǎo)入培養(yǎng)的細(xì)胞。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法始于1987年，這個(gè)方法的出現(xiàn)使得轉(zhuǎn)染效率、轉(zhuǎn)染的穩(wěn)定性和可重復(fù)性大大提高，并廣為使用。陽離子脂質(zhì)體細(xì)胞毒性相對較高，對不同的細(xì)胞可能會(huì)干擾細(xì)胞的代謝。血清的存在有可能會(huì)影響轉(zhuǎn)染效率，需要進(jìn)行優(yōu)化。通常轉(zhuǎn)染試劑有不同脂質(zhì)（lipid）和脂質(zhì)體（liposome）混合配方。

非脂質(zhì)體的脂質(zhì)（Non-liposomal lipids）：這個(gè)讀著頗為拗口的新一代技術(shù)，代表著脂質(zhì)體技術(shù)的未來發(fā)展方向——革新配方成分形成膠束（micellar）結(jié)構(gòu)而非簡單的雙層膜結(jié)構(gòu)，令核酸傳遞更有效率而且細(xì)胞毒性也顯著降低

活化的樹狀聚合物（Activated dendrimers）：這個(gè)確乎是Qiagen的獨(dú)門配方的Activated dendrimers本來真正屬于納米技術(shù)，高度樹狀分枝形成球形結(jié)構(gòu)有著均一的大小和形狀，借助每個(gè)球體無數(shù)活化的氨基末端凝聚在DNA上形成較為致密的結(jié)構(gòu)，并吸附在細(xì)胞膜上，經(jīng)過內(nèi)吞進(jìn)入細(xì)胞?；罨陌被梢哉{(diào)節(jié)胞內(nèi)融酶體的pH值，抑制降解活性，使得DNA穩(wěn)定存在。轉(zhuǎn)染的效率高，毒性低，可重復(fù)性好。血清的存在能顯著提高轉(zhuǎn)染效率。

多胺和新一代轉(zhuǎn)染介質(zhì)：多胺其實(shí)也是氨基多聚物，原理無非基于吸附帶負(fù)電的核酸形成非共價(jià)結(jié)合的復(fù)合物，結(jié)合并穿越同樣帶負(fù)電的細(xì)胞膜。優(yōu)點(diǎn)是可以攜帶較大的分子，而且細(xì)胞毒性也較低，不會(huì)干擾細(xì)胞代謝途徑。新一代轉(zhuǎn)染介質(zhì)并不局限于單一成分，各種不同配方的脂質(zhì)、加上蛋白質(zhì)組分、以及各種各樣的成分，務(wù)求令轉(zhuǎn)染效率更高，操作更方便，細(xì)胞毒性更低。還有的產(chǎn)品將脂質(zhì)偶聯(lián)到細(xì)胞膜特定受體蛋白的配基上，讓受體蛋白更有效率地轉(zhuǎn)運(yùn)DNA或者生物大分子復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞……

顯微注射和基因槍（Biolistic particle delivery）：顯微注射和基因槍是更特殊的導(dǎo)入DNA的方式：將DNA沉淀包被在極為微小的金顆粒（閃閃發(fā)光的金珠，gold beads）上，借助高壓基因槍將大分子直接“射”入細(xì)胞，一旦細(xì)胞接受，就會(huì)發(fā)生瞬時(shí)表達(dá)——這種方法多用于活體內(nèi)導(dǎo)入DNA，比如皮膚的DNA免疫。也有用于上皮細(xì)胞原代細(xì)胞的報(bào)告。是利用硅納米顆粒作為基因轉(zhuǎn)染載體。
顯微注射顧名思義就是使用一根超細(xì)針頭將DNA，RNA或蛋白直接注入細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核；整合的機(jī)會(huì)高一些，但適用這種方法的細(xì)胞好像不多，體外受精較為常見。這兩種方法需要的昂貴設(shè)備和相對復(fù)雜的技術(shù)，令普通實(shí)驗(yàn)室敬而遠(yuǎn)之。