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原核注射實(shí)驗(yàn)
- 公司名稱 上海達(dá)為科生物科技有限公司
- 品牌 其他品牌
- 型號(hào)
- 產(chǎn)地
- 廠商性質(zhì) 生產(chǎn)廠家
- 更新時(shí)間 2025/7/10 13:24:53
- 訪問(wèn)次數(shù) 119
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制作動(dòng)物模型 細(xì)胞培養(yǎng) 分子生物學(xué)檢測(cè) 病理學(xué)形態(tài)檢測(cè) 蛋白質(zhì)技術(shù) 免疫學(xué)檢測(cè) 提供培訓(xùn)服務(wù)各種檢驗(yàn)儀器設(shè)備、玻璃儀器及器具、一次性耗材等
一、技術(shù)定義與核心原理
原核注射是將外源DNA直接注入受精卵的雄性原核（體積較大且易定位），使外源基因隨機(jī)整合至宿主基因組的技術(shù)。其核心機(jī)制包括：
隨機(jī)整合：外源DNA通過(guò)非同源末端連接（NHEJ）插入染色體，整合位點(diǎn)與拷貝數(shù)不可控。
原核優(yōu)勢(shì)：雄性原核（由精子形成）比雌性原核更易定位，且DNA修復(fù)活性高。
瞬時(shí)表達(dá)窗口：受精卵處于單細(xì)胞期，DNA修復(fù)系統(tǒng)活躍，利于外源片段整合。
生物學(xué)基礎(chǔ)：
受精后12-24小時(shí)為最佳操作窗口（小鼠），此時(shí)原核清晰可見(jiàn)。
二、標(biāo)準(zhǔn)化操作流程
（一）前期準(zhǔn)備
| 步驟 | 關(guān)鍵操作與參數(shù) |
|---|---|
| 載體構(gòu)建 | 線性化載體（避免質(zhì)粒骨架整合） + 必需元件（啟動(dòng)子、編碼區(qū)、polyA） |
| 受精卵獲取 | 超排卵處理雌鼠（PMSG/hCG）→ 與雄鼠合籠→ 取見(jiàn)栓后0.5天的受精卵 |
| 顯微注射系統(tǒng)校準(zhǔn) | 注射針內(nèi)徑1-2μm，壓力5-10 hPa，單次注射體積2pL（含1-2ng DNA） |
（二）注射與胚胎移植
存活率控制：注射后受精卵存活率需＞80%。
移植時(shí)機(jī)：發(fā)育至2細(xì)胞期再移植，可提高著床率。
（三）首建鼠（Founder）鑒定
基因型檢測(cè)：
PCR法：提取鼠尾DNA，擴(kuò)增外源基因。
Southern Blot：驗(yàn)證拷貝數(shù)與整合完整性。
表達(dá)驗(yàn)證：
Western Blot（蛋白水平）或RT-PCR（轉(zhuǎn)錄水平）。
首建鼠特性：
每只Founder為獨(dú)立品系（因隨機(jī)整合位點(diǎn)不同），需分別建系。
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