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技術(shù)文章

蛋白樣品的定量

點(diǎn)擊次數(shù):5273 發(fā)布時(shí)間:2012-5-10

www.biomart.cn/runwell/index.htm

目前常用比色法測(cè)定樣品蛋白的含量:Bradford法(考馬斯亮藍(lán)法)、Lowry法(Folin-酚試劑法)、 BCA法等。但各有優(yōu)缺點(diǎn),大家可以根據(jù)具體情況選取。按相應(yīng)蛋白質(zhì)定量試劑盒操作說(shuō)明操作,測(cè)定樣品濃度。
收集完蛋白樣品后,為確保每個(gè)蛋白樣品的上樣量一致,需要測(cè)定每個(gè)蛋白樣品的蛋白濃度。根據(jù)所使用的裂解液的不同,需要采用適當(dāng)?shù)牡鞍诐舛葴y(cè)定方法。因?yàn)椴煌牡鞍诐舛葴y(cè)定方法對(duì)于一些去垢劑和還原劑等的兼容性差別很大,大家可以根據(jù)具體情況選取。
Bradford法(考馬斯亮藍(lán)法):
考馬斯亮藍(lán)G-250有紅、藍(lán)兩種不同顏色的形式,在一定濃度的乙醇和酸性條件下,可配成淡紅色的溶液,與蛋白結(jié)合后形成藍(lán)色化合物,該化合物在595 nm處有zui大吸收值,化合物顏色深淺與蛋白的濃度高低成正比。
該法操作簡(jiǎn)便迅速,消耗樣品量少,但不同蛋白質(zhì)之間差異大,且標(biāo)準(zhǔn)曲線線性差。高濃度的Tris、EDTA、尿素、甘油、蔗糖、丙酮、硫酸銨和去污劑對(duì)測(cè)定有干擾。緩沖液濃度過(guò)高時(shí),改變測(cè)定液pH值會(huì)影響顯色。
Lowry法(Folin-酚試劑法):
福林-酚試劑(Folin-phenol reagent的顯色原理是:首先在堿性條件下蛋白質(zhì)與銅作用生成蛋白質(zhì)-銅復(fù)合物,該復(fù)合物隨之將磷鉬酸-磷鎢酸還原成藍(lán)色復(fù)合物。在一定條件下,藍(lán)色強(qiáng)度與蛋白質(zhì)量成正比,蛋白質(zhì)濃度范圍約在25~250 μg/mL。
雖然該法是測(cè)定蛋白質(zhì)濃度應(yīng)用zui廣泛的方法之一,但其缺點(diǎn)也很明顯,專(zhuān)一性較差,干擾物質(zhì)多(如Tris緩沖劑、蔗糖、硫酸銨、巰基化物、酚類(lèi)、檸檬酸等),標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線關(guān)系不特別嚴(yán)格。因此在其應(yīng)用過(guò)程中有很多新的修正。
BCA法(二喹啉甲酸法):
二喹啉甲酸(Bicinchoninic acid,BCA )法是Lowry測(cè)定法的一種改進(jìn)方法,是近來(lái)廣為應(yīng)用的蛋白定量方法。其原理與Lowery法蛋白定量相似,即在堿性條件下蛋白質(zhì)分子中的肽鍵能與Cu2+絡(luò)合生成絡(luò)合物,同時(shí)將Cu2+還原成Cu+。二喹啉甲酸及其鈉鹽是一種溶于水的化合物,在堿性條件下,可以和Cu+結(jié)合形成穩(wěn)定的紫藍(lán)色復(fù)合物,在562 nm處有高的光吸收值,并且化合物顏色的深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比,據(jù)此可測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。
與Lowery法相比,BCA蛋白測(cè)定方法操作更簡(jiǎn)單,試劑及其形成的顏色復(fù)合物穩(wěn)定性更好,幾乎沒(méi)有干擾物質(zhì)的影響,靈敏度高(微量檢測(cè)可達(dá)到0.5 μg/ml),應(yīng)用更加靈活。與Bradford法相比,BCA法的顯著優(yōu)點(diǎn)是不受去垢劑的影響。
BCA法與Lowry法都容易受到蛋白質(zhì)之間以及去污劑的干擾。Bradford 法敏感度zui高,且與一系列干擾Lowry,BCA 反應(yīng)的還原劑(如DTT,巰基乙醇)相容。但是對(duì)于去污劑依然是敏感的,其zui主要的缺點(diǎn)是不同的標(biāo)準(zhǔn)品會(huì)導(dǎo)致同一樣品的結(jié)果差異較大,無(wú)可比性。

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