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技術(shù)文章

羅氏公司TUNEL細胞凋亡檢測程序

點擊次數(shù):3558 發(fā)布時間:2009-12-31

羅氏公司TUNEL細胞凋亡檢測程序

貨號:11684817910,In Situ Cell Death Detection Kit, POD,價格:5266.8

一、 原理:

TUNEL(TdT-mediated dUTP nick end labeling)細胞凋亡檢測試劑盒是用來檢測組織細胞在凋亡早期過程中細胞核DNA的斷裂情況。其原理是熒光素(fluorescein)標(biāo)記的dUTP在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶(TdT Enzyme)的作用下,可以連接到凋亡細胞中斷裂DNA的3’-OH末端,并與連接辣根過氧化酶(HRP,horse-radish peroxidase)的熒光素抗體特異性結(jié)合,后者又與HRP底物二氨基聯(lián)苯胺(DAB)反應(yīng)產(chǎn)生很強的顏色反應(yīng)(呈深棕色),特異準(zhǔn)確地定位正在凋亡的細胞,因而在光學(xué)顯微鏡下即可觀察凋亡細胞;由于正常的或正在增殖的細胞幾乎沒有DNA斷裂,因而沒有3‘-OH形成,很少能夠被染色。本試劑盒適用于組織樣本(石蠟包埋、冰凍和超薄切片)和細胞樣本(細胞涂片)在單細胞水平上的凋亡原位檢測。還可應(yīng)用于抗腫瘤藥的藥效評價,以及通過雙色法確定細胞死亡類型和分化階段。

二、 器材與試劑

器材:光學(xué)顯微鏡及其成像系統(tǒng)、小型染色缸、濕盒(塑料飯盒與紗布)、塑料蓋玻片或封口膜、吸管、各種規(guī)格的加樣器及槍頭等;

試劑:試劑盒含TdT 10×、熒光素標(biāo)記的dUTP 1×、標(biāo)記熒光素抗體的HRP;自備試劑:PBS、雙蒸水、二甲苯、梯度乙醇(100、95、90、80、70%)、DAB工作液(臨用前配制,5 μl 20×DAB+1μL 30%H2O2+94 μl PBS)、Proteinase K工作液(10-20 μg/ml in 10 mM Tris/HCl, pH 7.4-8)或細胞通透液(0.1% Triton X-100 in 0.1% sodium citrate,臨用前配制)、蘇木素或甲基綠、DNase 1(3000 U/ml– 3 U/ml in 50 mM Tris-HCl,pH 7.5, 10 mM MgCl2,1 mg/ml BSA)等。

三、 實驗步驟

操作流程圖:制作石蠟切片→脫蠟、水合→細胞通透→加TUNEL反應(yīng)液→加converter-POD→與底物DAB反應(yīng)顯色→光學(xué)顯微鏡計數(shù)并拍照。

具體操作步驟:

1. 用二甲苯浸洗2次,每次5min;

2. 用梯度乙醇(100、95、90、80、70%)各浸洗1次,每次3min;

3. PBS漂洗2次;

4. 用Proteinase K工作液處理組織15-30 min 在21–37°C(溫度、時間、濃度均需摸索)或者加細胞通透液8min;

5. PBS漂洗2次;

6. 制備TUNEL反應(yīng)混合液,處理組用50μl TdT+450μl 熒光素標(biāo)記的dUTP液混勻;而陰性對照組僅加50μl 熒光素標(biāo)記的dUTP液,陽性對照組先加入100μl DNase 1,反應(yīng)在15~25℃×10min,后面步驟同處理組。

7. 玻片干后,加50μl TUNEL反應(yīng)混合液(陰性對照組僅加50μl 熒光素標(biāo)記的dUTP液)于標(biāo)本上,加蓋玻片或封口膜在暗濕盒中反應(yīng)37℃×1h。

8. PBS漂洗3次;

9. 可以加1滴PBS在熒光顯微鏡下計數(shù)凋亡細胞(激發(fā)光波長為450~500nm,檢測波長為515~565nm);

10. 玻片干后加50μl converter-POD于標(biāo)本上,加蓋玻片或封口膜在暗濕盒中反應(yīng)37℃×30min。

11. PBS漂洗3次;

12. 在組織處加50~100μlDAB底物,反應(yīng)15~25℃×10min;

13. PBS漂洗3次;

14. 拍照后再用蘇木素或甲基綠復(fù)染,幾秒后立即用自來水沖洗。梯度酒精脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。

15. 加一滴PBS或甘油在視野下,用光學(xué)顯微鏡觀察凋亡細胞(共計200~500個細胞)并拍照??山Y(jié)合凋亡細胞形態(tài)特征來綜合判斷(未染色細胞變小,胞膜完整但出現(xiàn)發(fā)泡現(xiàn)象,晚期出現(xiàn)凋亡小體,貼壁細胞出現(xiàn)鄒縮、變圓、脫落;而染色細胞呈現(xiàn)染色質(zhì)濃縮、邊緣化,核膜裂解,染色質(zhì)分割成塊狀/凋亡小體)

四、 注意事項

1. 進行PBS 清洗時,每次清洗5 min。

2. PBS清洗后,為了各種反應(yīng)的有效進行,請盡量除去PBS 溶液后再進行下一步反應(yīng)。

3. 在載玻片上的樣本上加上實驗用反應(yīng)液后,請蓋上蓋玻片或保鮮膜,或在濕盒中進行,這樣可以使反應(yīng)液均勻分布于樣本整體,又可以防止反應(yīng)液干燥造成實驗失敗。

4. TUNEL反應(yīng)液臨用前配制,短時間在冰上保存。不宜長期保存,長期保存會導(dǎo)酶活性的失活。

5. 如果20×DAB 溶液顏色變深成為紫色,則不可使用,需重新配制。

6. 用甲基綠(Methyl Green)染液(3-5%甲基綠溶于0.1M 醋酸巴比妥 PH4.0)染色后,請用滅菌蒸餾水清洗多余的甲基綠。然后進行洗凈(100%乙醇)、脫水(二甲苯)透明、封片后通過光學(xué)顯微鏡觀察操作。如果此時使用80~90%的乙醇洗凈時,甲基綠比較容易脫色,注意快速進行脫水操作。

7. 熒光素標(biāo)記的dUTP液含甲次砷酸鹽和二氯鈷等致癌物,可通過吸入、口服等途徑進入機體,注意防護。

8. 試劑保存;未打開的試劑盒貯存在-20℃(-15~25℃);converter -POD液一旦解凍,以后就保存在4℃(2~8℃)下,至少在6 m內(nèi)穩(wěn)定,避免再次凍存;TUNEL反應(yīng)液臨用前配好后,放至冰上直至使用。

9. 結(jié)果分析時注意:在壞死的晚期階段或在高度增殖/代謝的組織細胞中可產(chǎn)生大量DNA片斷,從而引起假陽性結(jié)果;而有些類型的凋亡性細胞死亡缺乏DNA斷裂或DNA裂解不*,以及細胞外的矩陣成分阻止TdT進入胞內(nèi)反應(yīng),進而產(chǎn)生假陰性結(jié)果。

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