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技術(shù)文章

抗體使用常見問題解答

點擊次數(shù):2239 發(fā)布時間:2010-1-8

 

使用抗體常見問題解答

1
、如何選擇合適的一抗?

請先確定您要檢測的種屬和使用的實驗方法,然后查找相關(guān)產(chǎn)品,根據(jù)說明書上描述的“適用種屬和實驗方法”來確定合適的抗體。如果說明書中有明確您要檢測的種屬和實驗方法均經(jīng)過檢測,則您可以放心地購買該產(chǎn)品。
2、如何選擇合適的二抗?

二抗的選擇原則:

  • 針對一抗來源的二抗(比如一抗是小鼠來源的,二抗就要是抗小鼠的)
  • 針對一抗Ig亞型的(比如一抗是IgM,二抗就要是抗IgM的抗體)
  • 為了增加特異性、降低背景:可以選擇Fab段的抗體(去除Fc段的)、經(jīng)過標本來源種屬血清吸附的的二抗
  • 查看二抗的說明書,選擇經(jīng)過驗證可以用于相應(yīng)實驗方法的二抗

3、 如何選擇同型對照?

同型對照的主要目的是確定一抗的結(jié)合是特異性的,而不是非特異性的Fc受體或與其他蛋白的相互作用。同型對照要與一抗的來源、Ig分型和標記*一致。例如:一抗是FITC標記,其抗體分型是小鼠的IgG1,則同型對照要選擇是FITC標記的小鼠的IgG1。

多抗的同型對照:

絕大部分的同型對照產(chǎn)品都是單克隆抗體,因此不適用于作為多克隆抗體的對照(因為多抗含有多種IgG的亞型)。
4、如何選擇陽性對照?

陽性對照的使用是一個實驗中確定抗體及檢測系統(tǒng)是否正常工作的依據(jù),也是確定待測標本中是否存在待測蛋白的一個依據(jù)!尤其是檢測的標本是不確定是否有待測蛋白表達時。因此當(dāng)實驗沒有陽性結(jié)果出現(xiàn)時,的選擇是實驗合適的陽性對照。

說明書上都有推薦的陽性對照。但是如果說明書上沒有推薦時,請參考以下條款:

  • 看看說明書中是否有Abreviews。任何被其他客戶成功檢測的組織、細胞或者裂解物均可以作為合適的陽性對照!
  • 根據(jù)說明書上的Swiss-Prot 或 Omnigene 數(shù)據(jù)庫來查找。這些數(shù)據(jù)庫經(jīng)常會列出該蛋白表達的組織,這也可以作為合適的陽性對照!
  • 查查該蛋白的GeneCards 吧,這里通常會有蛋白在不同組織的表達水平。
  • 如果上述方法還是不能找到合適的陽性對照,推薦您去PubMed 查查發(fā)表文章,看看有無文章報道該蛋白表達的細胞和組織

5、如何確定一抗的稀釋比例?

如果說明書中有推薦的稀釋比例,請按照該稀釋比例進行實驗。但是由于標本類型、實驗條件、操作環(huán)境等各種因素的影響,推薦濃度僅作為參考。實驗者需要在推薦濃度周圍進行多個濃度梯度的實驗,從中發(fā)現(xiàn)*的稀釋比例。

如果說明書沒有推薦稀釋比例,僅注明“Use at an assay dependent dilution”,就需要做大量的預(yù)實驗來摸索*的比例了。下表列出的純化抗體抗體用于不同實驗方法時常用的工作濃度,可以作為預(yù)實驗的參考。未純化的抗體一般在說明書中不會標明抗體的濃度,因為大部分全抗血清、培養(yǎng)上清或腹水形式的產(chǎn)品濃度都是沒有經(jīng)過測定的。如果未純化抗體產(chǎn)品的說明書中沒有標明其中特異性抗體的濃度,實驗者可以參考下表中“估計濃度”確定各種實驗稀釋比例。

請記住,下表中的各種稀釋比例和工作濃度僅僅是作為一個起始點,需要根據(jù)試驗結(jié)果來進行適當(dāng)?shù)恼{(diào)整。以此起點作一系列的濃度,從中確定*的工作濃度和稀釋比例!

 
組織培養(yǎng)上清
腹水
全抗血清
純化抗體
WB / dot blot
1/100
1/1000
1/500
1 ug/ml
IHC / ICC
neat - 1/10
1/100
1/50 - 1/100
5 ug/ml
EIA / ELISA
1/1000
1/10000
1/5000
0.1 ug/ml
FC
1/100
1/1000
1/500
1 ug/ml
IP
 
1/100
1/50-1/100
1 - 10 ug/ml
Concentration estimate
1 - 3 mg/ml
5 - 10 mg/ml
1 - 10 mg/ml
 

6、如何確定適用于某種特定抗體的抗原修復(fù)方法?

有些抗體對抗原修復(fù)方式有特別要求的,一般在其說明書中都會有明確的標注和推薦。但是很多抗體并沒有一個特別的推薦,就需要實驗者自己來進行優(yōu)化和摸索了。
7、為何實際檢測到的WB條帶與預(yù)期的有所區(qū)別?

WB是根據(jù)蛋白質(zhì)的大小來分離蛋白的,通常小分子量蛋白在凝膠中的遷移速度要快。但是遷移率也是受到其他因素影響的,這就造成了實際檢測到的條帶與預(yù)期條帶的不一致。主要有以下幾種常見因素:

  • 翻譯后修飾-比如磷酸化、糖基化等,這些修飾會增加蛋白質(zhì)的分子量
  • 翻譯后剪切- 比如很多蛋白是以前體蛋白的形式合成的,在執(zhí)行功能時需要進行剪切成活化的形式,如pro-caspases
  • 不同剪切體 – 有些來源于同一基因的蛋白有不同的剪切方式,每個剪切方式得到的蛋白大小都是不同的
  • 相對電荷(Relative charge – 氨基酸的組成(charged vs non-charged)
  • 多聚體-如二聚體或三聚體。這些多聚體的形式通常會抵制WB時所做的還原條件,因此造成檢測的條帶偏大。

 

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