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抗體使用常見問題解答
點擊次數(shù)：2239 發(fā)布時間：2010-1-8
請先確定您要檢測的種屬和使用的實驗方法，然后查找相關(guān)產(chǎn)品，根據(jù)說明書上描述的“適用種屬和實驗方法”來確定合適的抗體。如果說明書中有明確您要檢測的種屬和實驗方法均經(jīng)過檢測，則您可以放心地購買該產(chǎn)品。
2、如何選擇合適的二抗?
二抗的選擇原則：
- 針對一抗來源的二抗（比如一抗是小鼠來源的，二抗就要是抗小鼠的）
- 針對一抗Ig亞型的（比如一抗是IgM，二抗就要是抗IgM的抗體）
- 為了增加特異性、降低背景：可以選擇Fab段的抗體（去除Fc段的）、經(jīng)過標本來源種屬血清吸附的的二抗
- 查看二抗的說明書，選擇經(jīng)過驗證可以用于相應(yīng)實驗方法的二抗
同型對照的主要目的是確定一抗的結(jié)合是特異性的，而不是非特異性的Fc受體或與其他蛋白的相互作用。同型對照要與一抗的來源、Ig分型和標記*一致。例如：一抗是FITC標記，其抗體分型是小鼠的IgG1，則同型對照要選擇是FITC標記的小鼠的IgG1。
多抗的同型對照：
絕大部分的同型對照產(chǎn)品都是單克隆抗體，因此不適用于作為多克隆抗體的對照（因為多抗含有多種IgG的亞型）。
4、如何選擇陽性對照?
陽性對照的使用是一個實驗中確定抗體及檢測系統(tǒng)是否正常工作的依據(jù)，也是確定待測標本中是否存在待測蛋白的一個依據(jù)！尤其是檢測的標本是不確定是否有待測蛋白表達時。因此當(dāng)實驗沒有陽性結(jié)果出現(xiàn)時，的選擇是實驗合適的陽性對照。
說明書上都有推薦的陽性對照。但是如果說明書上沒有推薦時，請參考以下條款：
- 看看說明書中是否有Abreviews。任何被其他客戶成功檢測的組織、細胞或者裂解物均可以作為合適的陽性對照！
- 根據(jù)說明書上的Swiss-Prot 或 Omnigene 數(shù)據(jù)庫來查找。這些數(shù)據(jù)庫經(jīng)常會列出該蛋白表達的組織，這也可以作為合適的陽性對照！
- 查查該蛋白的GeneCards 吧，這里通常會有蛋白在不同組織的表達水平。
- 如果上述方法還是不能找到合適的陽性對照，推薦您去PubMed 查查發(fā)表文章，看看有無文章報道該蛋白表達的細胞和組織
如果說明書中有推薦的稀釋比例，請按照該稀釋比例進行實驗。但是由于標本類型、實驗條件、操作環(huán)境等各種因素的影響，推薦濃度僅作為參考。實驗者需要在推薦濃度周圍進行多個濃度梯度的實驗，從中發(fā)現(xiàn)*的稀釋比例。
如果說明書沒有推薦稀釋比例，僅注明“Use at an assay dependent dilution”，就需要做大量的預(yù)實驗來摸索*的比例了。下表列出的純化抗體抗體用于不同實驗方法時常用的工作濃度，可以作為預(yù)實驗的參考。未純化的抗體一般在說明書中不會標明抗體的濃度，因為大部分全抗血清、培養(yǎng)上清或腹水形式的產(chǎn)品濃度都是沒有經(jīng)過測定的。如果未純化抗體產(chǎn)品的說明書中沒有標明其中特異性抗體的濃度，實驗者可以參考下表中“估計濃度”確定各種實驗稀釋比例。
請記住，下表中的各種稀釋比例和工作濃度僅僅是作為一個起始點，需要根據(jù)試驗結(jié)果來進行適當(dāng)?shù)恼{(diào)整。以此起點作一系列的濃度，從中確定*的工作濃度和稀釋比例！
| | 組織培養(yǎng)上清 | 腹水 | 全抗血清 | 純化抗體 |
| WB / dot blot | 1/100 | 1/1000 | 1/500 | 1 ug/ml |
| IHC / ICC | neat - 1/10 | 1/100 | 1/50 - 1/100 | 5 ug/ml |
| EIA / ELISA | 1/1000 | 1/10000 | 1/5000 | 0.1 ug/ml |
| FC | 1/100 | 1/1000 | 1/500 | 1 ug/ml |
| IP | | 1/100 | 1/50-1/100 | 1 - 10 ug/ml |
| Concentration estimate | 1 - 3 mg/ml | 5 - 10 mg/ml | 1 - 10 mg/ml | |
有些抗體對抗原修復(fù)方式有特別要求的，一般在其說明書中都會有明確的標注和推薦。但是很多抗體并沒有一個特別的推薦，就需要實驗者自己來進行優(yōu)化和摸索了。
7、為何實際檢測到的WB條帶與預(yù)期的有所區(qū)別？
WB是根據(jù)蛋白質(zhì)的大小來分離蛋白的，通常小分子量蛋白在凝膠中的遷移速度要快。但是遷移率也是受到其他因素影響的，這就造成了實際檢測到的條帶與預(yù)期條帶的不一致。主要有以下幾種常見因素：
- 翻譯后修飾－比如磷酸化、糖基化等，這些修飾會增加蛋白質(zhì)的分子量
- 翻譯后剪切－ 比如很多蛋白是以前體蛋白的形式合成的，在執(zhí)行功能時需要進行剪切成活化的形式，如pro-caspases
- 不同剪切體 – 有些來源于同一基因的蛋白有不同的剪切方式，每個剪切方式得到的蛋白大小都是不同的
- 相對電荷（Relative charge） – 氨基酸的組成（charged vs non-charged）
- 多聚體－如二聚體或三聚體。這些多聚體的形式通常會抵制WB時所做的還原條件，因此造成檢測的條帶偏大。