顯微課堂 | “Waffle方法“：使用高壓冷凍制備復(fù)雜樣品

使用電鏡載網(wǎng)作為載體，減少樣品厚度，以支持高效的低溫電子顯微鏡工作流程。

本文介紹了一種特殊的高壓冷凍方法，即 "Waffle 方法 "的優(yōu)點(diǎn)。了解 "Waffle 方法 "如何使用電鏡載網(wǎng)作為高壓冷凍的載體，從而減少樣本厚度并支持復(fù)雜生物樣本的高效低溫電子顯微鏡工作流程。此外，本文還強(qiáng)調(diào)了現(xiàn)代 HPF 系統(tǒng)-徠卡顯微系統(tǒng)公司 EM ICE 的優(yōu)勢，并列舉了 EM ICE 用于 "Waffle方法 "的參考文獻(xiàn)。

"Waffle 方法 "

高壓冷凍（HPF）已成為低溫電子斷層成像技術(shù)（cryo-ET）的基石，它能以很高的保真度保存原始生物結(jié)構(gòu)，尤其是在厚樣本或復(fù)雜樣本中。為此，通常要在冷凍樣品，并所形成的最大200微米玻璃化區(qū)域。遺憾的是，玻璃化后的大體積樣品，必須在多個(gè)維度上進(jìn)行銑削，以制備樣品薄片，然后才能進(jìn)行電子斷層掃描。

近年來有一種樣品制備方法越來越流行：“Waffle方法"，特別是對(duì)于較厚的樣品。這種方法的基礎(chǔ)由McDonald等人在2010年奠定，并由Mahamid等人在2015年進(jìn)一步調(diào)整，他們首先使用載網(wǎng)作為HPF銅盤之間的樣品載體（圖 4）。隨后，Kelley等人在2022年的一項(xiàng)研究中正式采用了 "華夫餅法 "這一術(shù)語，對(duì)該技術(shù)進(jìn)行了標(biāo)準(zhǔn)化，并將其應(yīng)用擴(kuò)展到各種生物系統(tǒng)中。

與標(biāo)準(zhǔn)的 HPF 厚樣品相比，該技術(shù)的優(yōu)勢在于為后續(xù)的FIB銑削提供了更小體積的樣品。樣品被放入載網(wǎng)中，碳膜面朝下。這樣，在HPF制備后，柵格內(nèi)會(huì)形成一個(gè)玻璃化的 "圓盤"，厚度約為20-30 µm，而不是100-200 µm。因此，樣品所需玻璃化冰層深度大大減少。圖 1 顯示了成功進(jìn)行HPF制備后，電鏡載網(wǎng)上的小鼠海馬腦切片熒光圖像（Matsui等人，2024年）。

圖 1：HPF 制備后載網(wǎng)上的小鼠海馬腦切片結(jié)果；綠色熒光為PSD95-EGFP。Aya Matsui, Cathy Spangler, Johannes Elferich, Momoko Shiozaki, Nikki Jean, Xiaowei Zhao, Maozhen Qin, Haining Zhong, Zhiheng Yu, Eric Gouaux (2024) Cryo-electron tomographic investigation of native hippocampal glutamatergic synapses eLife 13:RP98458;

載網(wǎng)骨架可以穩(wěn)定網(wǎng)格方格中的結(jié)構(gòu)，以便進(jìn)行FIB銑削，尤其是在獲得約200納米薄片時(shí)。在Kelley等人繪制的圖2中，我們可以看到隱藏在圖像下的載網(wǎng)骨架。在載網(wǎng)骨架上方，有5對(duì)明顯的溝槽，以便隨后對(duì)目標(biāo)薄片進(jìn)行精細(xì)銑削。

圖 2：5 對(duì)預(yù)制溝槽的Waffle樣品的掃描電鏡圖像。在圖像的下部，可以看到電鏡載網(wǎng)的柵條。比例尺：100 微米。Kelley, K., Raczkowski, A.M., Klykov, O. et al. Waffle Method: A general and flexible approach for improving throughput in FIB-milling. Nat Commun 13, 1857 (2022).

圖 3 顯示了一個(gè)薄片樣品，在所有方向上都有微孢子蟲，它是通過 "Waffle方法 "制備的，沒有使用冷凍投入技術(shù)。

圖 3：一個(gè)完整的Waffle薄片樣品（右側(cè)為缺口磨盤）的SEM圖像，顯示了微孢子蟲孢子的幾種排列方向。比例尺：10 微米。Kelley, K., Raczkowski, A.M., Klykov, O. et al. Waffle Method: A general and flexible approach for improving throughput in FIB-milling.Nat Commun 13, 1857 (2022).

除了上述優(yōu)點(diǎn)外，載網(wǎng)還可以最終安裝到低溫-TEM 固定器中，而標(biāo)準(zhǔn)厚樣品則無法做到這一點(diǎn)。這就避免使用復(fù)雜的樣品轉(zhuǎn)移方法，以及將薄片轉(zhuǎn)移到特定支架上進(jìn)行低溫 TEM 層析成像的危險(xiǎn)步驟。

先進(jìn)的自動(dòng)高壓冷凍儀：EM ICE

EM ICE 高壓冷凍機(jī)特別適用于 "Waffle方法"，因?yàn)樗袔讉€(gè)主要特點(diǎn)，符合該方法對(duì)精確性、可重復(fù)性以及與大體積或結(jié)構(gòu)化樣品的兼容性的要求：

兼容載網(wǎng)作為樣品載體

“Waffle方法 "是將樣品放在由兩個(gè)拋光銅盤夾著的載網(wǎng)中。EM ICE支持根據(jù)試樣需要定制銅盤和隔板，從而實(shí)現(xiàn)一致的試樣厚度的冷凍幾何形狀。根據(jù)試樣的大小，可使用不同的載網(wǎng)類型（網(wǎng)格孔直徑從90微米到500微米不等，通常為正方形，也有六邊形）。

圖 4：使用"Waffle 方法 "的 HPF 典型設(shè)置。

高通量和可重復(fù)性

EM ICE設(shè)計(jì)用于可重復(fù)的冷凍循環(huán)，這在制備多個(gè) "Waffle "樣品用于高通量低溫 FIB 銑削時(shí)至關(guān)重要。

樣品干擾小

該系統(tǒng)可對(duì)樣品進(jìn)行溫和處理，并快速轉(zhuǎn)移到液氮中，從而降低了機(jī)械損傷或蛻變的風(fēng)險(xiǎn)--這在處理精細(xì)的載網(wǎng)組件時(shí)尤為重要。

與下游低溫工作流程集成

EM ICE廣泛應(yīng)用于包括Cryo-FIB/SEM和Cryo-ET在內(nèi)的工作流程，使其成為 "Waffle方法 "的天然之選，而 "Waffle方法 "依賴于從冷凍到銑削，再到成像的有效工作流程。

使用EM ICE進(jìn)行"Waffle方法 "樣品制備

最近，Pge等人（elifeSciences）將使用 "Waffle方法 "的樣品制備技術(shù)擴(kuò)展到植物組織 。研究人員使用了苔蘚、擬南芥和雙色檸檬（海熏衣草）的組織。

Schi?tz等人在《自然-方法》（Nature Methods）雜志上介紹了 "序列提取"（Serial Lift-Out）技術(shù)，該技術(shù)結(jié)合了HPF和高通量Cryo-FIB銑削技術(shù)，可從單個(gè)樣本中提取多個(gè)薄片。這樣就能對(duì)多細(xì)胞生物體進(jìn)行體積取樣，例如C. elegans同時(shí)保持大面積組織的完整的超微結(jié)構(gòu)。

在eLife中， Matsui等人將HPF應(yīng)用于小鼠腦組織，并將其與低溫光電聯(lián)用技術(shù)相結(jié)合，研究原生海馬突觸 。他們的方法確保了神經(jīng)回路的快速玻璃化，從而可以在原位對(duì)AMPA受體進(jìn)行精確定位和結(jié)構(gòu)分析。

Berger等人（bioRxiv）證明了HPF與氙等離子FIB銑削技術(shù)的兼容性，實(shí)現(xiàn)了從厚樣品中高通量制備薄片。他們的工作實(shí)現(xiàn)了近原子分辨率的重建，如大腸桿菌4.0 ? 的核糖體 ，強(qiáng)調(diào)了 HPF 在保護(hù)大分子結(jié)構(gòu)方面的關(guān)鍵作用。

致謝

本應(yīng)用說明展示了以下文章的圖片，采用知識(shí)共享許可協(xié)議（署名 4.0 國際版），如 CreativeCommons

Waffle Method: A general and flexible approach for improving throughput in FIB-milling.

Kelley, K., Raczkowski, A.M., Klykov, O. et al.

Nat Commun 13, 1857 (2022)。

Cryo-electron tomographic investigation of native hippocampal glutamatergic synapses

Aya Matsui, Cathy Spangler, Johannes Elferich, Momoko Shiozaki, Nikki Jean, Xiaowei Zhao, Maozhen Qin, Haining Zhong, Zhiheng Yu, Eric Gouaux

eLife 13:RP98458 (2024).

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EM ICE高壓冷凍儀