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抗雙鏈DNA(ds-DNA)抗體檢測

時間:2009/8/8閱讀:1237
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抗雙鏈DNA(ds-DNA)抗體檢測

 

    抗雙鏈DNA(ds-DNA)抗體對SLE有較高的特異性,因此美國及中國對SLE的診斷標準中都已列入抗ds-DNA測定。檢測抗ds-DNA的方法很多,如免疫沉淀雙向擴散與對流免疫電泳、間接血凝、間接熒光抗體(DNA斑點法、短膜蟲法、間接酶標抗體染色短膜蟲、ELISARIA等?,F(xiàn)應用較多的是RIA(FarrELISA、間接熒光抗體短膜蟲(CL-IFA)。

 

    蘭小鵬等(1994)以純化的大腸桿菌質粒ds-DNA為抗原,利用親合素生物素系統(tǒng)(BAS),將其結合在硝酸纖維素(NC)膜上,建立了一種新型的檢測ds-DNA抗體的斑點免疫結合試驗(dot immunobinding assay,DIBA)。DIBA的敏感性優(yōu)于CL-IFA,特異性優(yōu)于ELISA試劑盒。DIBA檢測ds-DNA快速、簡便、可靠,如有試劑盒供應,可作為檢測ds-DNA抗體的常規(guī)方法。現(xiàn)將DIBA檢測ds-DNA法介紹如下。

 

    1.試劑  生物素化質粒ds-DNA:將含質粒pBR332的大腸桿菌在含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中擴增,取純培養(yǎng)物用MagicTM DNA純化系統(tǒng),按Promega公司所附操作說明書提取質粒ds-DNA。取純化的不含單鏈DNA的大腸桿菌質粒ds-DNA直接與長臂光敏生物素混合,用光標記燈進行光照標記,以制備生物素化質粒ds-DNA??蓞⒖家韵虏襟E:在一滅菌EP管中加待標記DNA 5ug10uL,在暗室中加入5uguL光敏生物素,充分混勻,置冰浴中。

 

    在特制光源下10cm處照射20min。加入100mmolLTris-HClpH90(01mmolLEDTA)10uL,混勻。再加入等體積仲丁醇,混勻。離心lmin(10 000rrain),吸去上層仲丁醇,棄去。再加入仲丁醇25uL,重復提取游離的光敏生物素。吸去上層無色仲丁醇后,加入5uL3molL醋酸鈉,充分混勻,加入冷*100gL充分混勻,沉淀標記的DNA,置-20過夜-70l5min)15 000rmin離心20min,沉淀物再用70%乙醇洗1次,離心,抽干,溶于01mmolLEDTATK中,測定探針濃度,分裝,保存于-20。

 

    2.操作步驟

    (1)DIBA反應板制作  取厚約05mm的硬質透明膠片,用打孔器打直徑為3mm的圓孔,在膠片一面貼透明膠紙,取與膠板上的圓孔等大的NC片,嵌貼人上述膠板的孔內即成DIBA微量反應板。NC片經001molL,pH74PBS濕潤后,加入如L親合素(50ugmL),37干燥。再加生物素化的質粒ds-DNA(25ugmL),3730min,用含3BSAPBS封閉30min;經含005Tween-20PBS漂洗后,吹干,置冰箱保存?zhèn)溆谩?/span>

 

    (2)標本檢測  在上述NC片上加入用含3BSAPBS 140稀釋的待檢血清,37反應30rain,振蕩漂洗;加羊抗人ISC-HRP(1100)37~Clh;漂洗后加底物(DAB-H20),顯色。

 

    (3)結果判定  NC片*出現(xiàn)棕色斑點為陽性,陽性強弱以出現(xiàn)棕色斑點的血清zui高稀釋度表示,血清140稀釋時*不顯色則為陰性。

 

    3.臨床意義  ds-DNA抗體的檢測對于SLE的診斷和治療監(jiān)控極為重要。其他結締組織性疾病患者抗ds-DNA也可出現(xiàn)陽性,但此類病人一般是SLE重疊綜合征,故抗ds-DNA抗體是SLE診斷標準之一。

 

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