ELISA法檢測干擾素

ELISA法檢測干擾素

    干擾素（IFN）是一類具有廣譜抗病毒活性的蛋白質(zhì)，僅在同種細胞上發(fā)揮作用。根據(jù)其來源、理化及生物學性質(zhì)的不同，可分為IFN-α、IFN-β、IFN-γ3種干擾素。其中，IFN-α主要由白細胞產(chǎn)生，IFN-β由成纖維細胞產(chǎn)生，IFN-γ主要由T細胞在免疫應答中受到抗原或絲裂原活化后分泌產(chǎn)生。3種干擾素中，IFN-α、IFN-β抗病毒作用較強，IFN-丁免疫調(diào)節(jié)作用較強。目前已可用基因重組技術制備干擾素投入臨床使用。干擾素不能直接滅活病毒，其抗病毒作用是由于它能激活細胞內(nèi)抗病毒蛋白基因，制造抗病毒蛋白，抑制病毒在體內(nèi)復制。干擾素不僅可抑制已感染細胞內(nèi)病毒的復制，而且還可使未感染細胞處于抗病毒狀態(tài)，對中斷病毒的細胞間傳播有一定作用；但對病毒整合基因可能僅有暫時抑制其mRNA的轉(zhuǎn)錄作用，不能清除病毒基因。干擾素的免疫調(diào)節(jié)作用表現(xiàn)為它是重要的巨噬細胞活化因子（macro-phageactivating factor，MAF），活化的巨噬細胞能殺死病原微生物或殺傷腫瘤細胞。干擾素能增強各種細胞表達MAF分子從而有利于遞呈抗原或利于T細胞對靶細胞的識別和殺傷；還能促進T、B細胞的分化，活化NK細胞和中性粒細胞，從而有助于加強免疫應答。由于干擾素不是一種淋巴細胞的生長因子，故常抑制淋巴細胞（特別是B細胞）的增殖。

    IFN抗病毒活性的特點如下：①僅僅是抑制作用，IFN消失后病毒將重新復制，因此必須足量反復應用；②有相對的種屬特異性，IFN-γ較IFN-α、IFN-β嚴格；③IFN不直接滅活病毒，而是通過細胞基因組產(chǎn)生另一些蛋白因子來發(fā)揮效能，因此不同細胞對IFN的敏感性不同；④不同感染狀態(tài)的病毒-細胞系統(tǒng)對IFN的敏感性不同，病毒大量復制、引起細胞炎癥應答時，IFN易產(chǎn)生效應；對完整細胞中的整合型病毒無作用。

    [檢測方法]  ELISA法

    [方法學原理]  抗人IFN抗體包被在微孔反應板上，待測標本和標準品中的IFN會與抗人IFN抗體結(jié)合，游離的成分被洗去，同時加入生物素化的抗人IFN抗體和辣根過氧化物酶標記的親和素。生物素與親和素特異結(jié)合，抗人IFN抗體與結(jié)合在單克隆抗體上的人IFN結(jié)合而形成免疫復合物，游離的成分被洗去。加入顯色劑，若反應孔中有IFN，HRP會使五色的顯色劑呈現(xiàn)藍色，加終止液變黃色。在波長450nm處測吸光度，IFN濃度與吸光度成正比，可通過繪制標準曲線求出標本中的IFN濃度。

    [標本準備]  靜脈血2ml，不抗凝。

    [試劑）

    1．預包被微孔反應板

    2．濃縮酶結(jié)合物

    3．酶結(jié)合物稀釋液

    4．標準晶和標本稀釋液

    5．濃縮生物素化抗體

    6．TFN標準品

    7．濃縮洗滌液

    8.顯色劑A、B

    9．終止液

    [儀器]  酶標儀或全自動酶聯(lián)免疫檢測儀。

    [檢測步驟]

    1．在微孔反應板相應孔中分別加入待測樣本、不同濃度標準品100ul，再加生物素化抗體工作液50ul。

    2．振蕩混勻，置20～25℃環(huán)境中溫育120min。

    3．將孔內(nèi)液體吸干，用洗滌液充分洗滌5次，干燥。

    4．除空白孔外，加入酶結(jié)合物工作液100u1。   

    5．振蕩混勻，置20～25℃環(huán)境中溫育30min。

    6．將孔內(nèi)液體吸干，用洗滌液充分洗滌5次，干燥。

    7．每孔加入顯色劑A、B各50ul，輕輕振蕩混勻，37℃環(huán)境中避光顯色10min。

    8．加入終止液50gl后，輕輕振蕩混勻。用酶標儀（450nm波長）測定各孔吸光度，與標準曲線對照，求出IFN值。

    [正常參考值]  各實驗室可根據(jù)檢測方法的不同確立正常參考值。

    [注意事項]

    1．試劑盒從冷藏環(huán)境中取出時應在室溫環(huán)境中平衡30min后方可使用，來用完的微孔條用自封袋密封保存。

    2．酶標板洗滌時各孔均需加滿洗滌液，防止孔內(nèi)有游離酶不能洗凈。應設定30-60s的洗滌浸泡時間。

    3。滴加試劑前應將滴瓶翻轉(zhuǎn)數(shù)次，使液體混勻。滴加時瓶身應保持垂直，以使滴量準確。

    4.所有樣品和廢棄物都應按傳染源處理。終止液為2mol／L硫酸，使用時應注意安全

    5.每批樣本應同時做標準曲線。

    6.檢測劑工作液按說明書臨用前配置。

    7.若標本OD值在標準曲線測定范圍以外，應適當稀釋后重測。

[臨床意義]  IFN水平的改變主要見于自身免疫性疾病；在感染性疾病中，升高見于急性病毒感染，降低見于乙型肝炎病毒攜帶者、其他慢性病毒性肝炎及AIDS患者。

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