基因擴(kuò)增

基因擴(kuò)增-簡要概述 

Myc基因擴(kuò)增形成雙微核（黃色）的核型
細(xì)胞內(nèi)選擇性復(fù)制DNA,產(chǎn)生大量的拷貝。如兩棲類卵母細(xì)胞在發(fā)育的早期，rRNA基因的數(shù)量擴(kuò)增到1000多倍?；驍U(kuò)增是通過形成幾千個核進(jìn)行的，每個核里含有幾百拷貝的編碼28S、18S和5.8S的rRNA基因，zui后卵母細(xì)胞中的這些rRNA基因的拷貝數(shù)幾乎達(dá)到50萬個，而在相同生物的其它類型細(xì)胞中，這些rRNA基因的拷貝數(shù)只有幾百個。卵母細(xì)胞中有如此眾多的rRNA基因拷貝，為卵細(xì)胞在受精后的發(fā)育過程中合成大量核糖體創(chuàng)造了條件。
至于卵母細(xì)胞中rRNA的機(jī)制，有人認(rèn)為可能是通過從染色體上分離出來的環(huán)狀DNA分子，這種環(huán)狀DNA中含有rRNA基因，但是*個含有rRNA基因的環(huán)狀DNA是如何形成的尚不清楚。由于環(huán)狀DNA能夠通過滾環(huán)復(fù)制（rollingcirclereplication）的方式進(jìn)行復(fù)制，因而能夠產(chǎn)生大量的rRNA基因。

為一特異蛋白質(zhì)編碼的基因的拷貝數(shù)選擇性地增加而其他基因并未按比例增加的過程。在自然條件下，是通過從染色體切除基因的重復(fù)序列再在質(zhì)粒中進(jìn)行染色體外復(fù)制或通過將核糖體RNA的全部重復(fù)序列生成RNA轉(zhuǎn)錄物再轉(zhuǎn)錄生成原來DNA分子的額外拷貝而實現(xiàn)的。在實驗室已建立了不等交換、從裂解細(xì)胞提取DNA或經(jīng)過滾環(huán)復(fù)制（rollingcirclereplication）生成染色體外序列進(jìn)行人工。例如，在非洲爪蟾的卵母細(xì)胞中原有rRNA基因（rDNA）約200個拷貝，在減數(shù)分裂Ⅰ的粗線期，這個基因開始迅速復(fù)制，到雙線期它的拷貝數(shù)約為200萬個，擴(kuò)增近4000倍，可用于合成10的12次方個核糖體，以滿足卵裂期和胚胎期合成大量蛋白質(zhì)的需要。在果蠅中也發(fā)現(xiàn)了現(xiàn)象。在卵巢成熟之前，卵巢顆粒細(xì)胞中產(chǎn)生卵殼蛋白的基因被擴(kuò)增。果蠅中的卵原細(xì)胞，經(jīng)4次分裂產(chǎn)生16個細(xì)胞，其中一個是卵母細(xì)胞（oocyte），將發(fā)育成為卵細(xì)胞，其他15個是營養(yǎng)細(xì)胞（nursecell），它們?yōu)槁鸭?xì)胞的形成提供大量的蛋白質(zhì)及其他大分子物質(zhì)，營養(yǎng)細(xì)胞之所以能夠產(chǎn)生大量的營養(yǎng)物質(zhì)，是因為它們在形成的過程中發(fā)生了多次特殊的DNA復(fù)制，卵殼蛋白等基因拷貝數(shù)顯著增加。

-實驗應(yīng)用 
1、概述

實驗室
臨床實驗又稱PCR實驗，是專門用來檢驗艾滋病、乙型肝炎、禽疫病等病毒感染性疾病的一種檢測手段。它可以通過將病毒體內(nèi)所含的基因進(jìn)行擴(kuò)增的方法，測出一些病毒含量不高的感染者體內(nèi)是否含有特定的病毒。由于該檢測方法可以測出普通檢驗難以檢測出的病毒并具有靈敏度高、特異性高、快捷、對樣品要求低等優(yōu)點，因此被臨床醫(yī)生廣為認(rèn)可，已廣泛應(yīng)用于醫(yī)院的臨床診斷和各防疫檢測部門的禽疫病診斷。但是，這種實驗需要有能保證安全、配置合理的實驗室和非常規(guī)范的操作為前提。近年來對臨床檢驗實驗室的建設(shè)越來越得到重視，因為它對檢測結(jié)果的可靠性、準(zhǔn)確性和安全性起到至關(guān)重要的作用。本文主要從臨床檢驗實驗室的平面布局，空調(diào)通風(fēng)系統(tǒng)設(shè)計、氣流控制和污染的防制幾個方面對實驗室設(shè)計中的主要特點進(jìn)行了闡述。臨床檢驗實驗室設(shè)計的核心問題是如何避免污染。因此，實驗室的平面布局、空調(diào)通風(fēng)系統(tǒng)設(shè)計、氣流控制等都是圍繞這個核心問題進(jìn)行的。下面就對這幾個方面分別進(jìn)說明。
2、PCR實驗室平面布局
臨床檢驗實驗室原則上分為四個單獨的工作區(qū)域：試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)、標(biāo)本制備區(qū)、擴(kuò)增反應(yīng)混合物配制和擴(kuò)增區(qū)、擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)。為避免交叉污染，進(jìn)入各個工作區(qū)域必須嚴(yán)格遵循單一方向進(jìn)行，即只能從試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)→標(biāo)本制備區(qū)→擴(kuò)增反應(yīng)混合物配制和擴(kuò)增區(qū)→擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)。各實驗區(qū)之間的試劑及樣品傳遞應(yīng)通過傳遞窗進(jìn)行。

3實驗室空調(diào)通風(fēng)系統(tǒng)設(shè)計及壓力控制
PCR實驗室并沒有嚴(yán)格的凈化要求，但是為避免各個實驗區(qū)域間交叉污染的可能性，宜采用全送全排的氣流組織形式。同時，要嚴(yán)格控制送、排風(fēng)的比例以保證各實驗區(qū)的壓力要求。
3.1試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)
該實驗區(qū)主要進(jìn)行的操作為貯存試劑的制備、試劑的分裝和主反應(yīng)混合液的制備。試劑和用于標(biāo)本制作的材料應(yīng)直接運送至該區(qū)，不得經(jīng)過其他區(qū)域。試劑原材料必須貯存在本區(qū)內(nèi)，并在本區(qū)內(nèi)制備成所需的貯存試劑。對與氣流壓力的控制，本區(qū)并沒有嚴(yán)格的要求。

3.2標(biāo)本制備區(qū)
該區(qū)域主要進(jìn)行的操作為臨床標(biāo)本的保存、核酸（RNA、DNA）提取、貯存及其加入至擴(kuò)增反應(yīng)管和測定RNA時cDNA的合成。本區(qū)的壓力梯度要求為：相對于鄰近區(qū)域為正壓，以避免從鄰近區(qū)進(jìn)入本區(qū)的氣溶膠污染。另外，由于在加樣操作中可能會發(fā)生氣溶膠所致的污染，所以應(yīng)避免在本區(qū)內(nèi)不必要的走動。

3.3擴(kuò)增反應(yīng)混合物配制和擴(kuò)增區(qū)
該區(qū)域主要進(jìn)行的操作為DNA或cDNA擴(kuò)增。此外，已制備的DNA模板和合成的cDNA（來自樣本制備區(qū)）的加入和主反應(yīng)混合液（來自試劑貯存和制備區(qū)）制備成反應(yīng)混合液等也可在本區(qū)內(nèi)進(jìn)行。在巢式PCR測定中，通常在*輪擴(kuò)增后必須打開反應(yīng)管，因此巢式擴(kuò)增有較高的污染危險性，第二次加樣必須在本區(qū)內(nèi)進(jìn)行。本區(qū)的壓力梯度要求為：相對于鄰近區(qū)域為負(fù)壓，以避免氣溶膠從本區(qū)漏出。為避免氣溶膠所致的污染，應(yīng)盡量減少在本區(qū)內(nèi)的不必要的走動。個別操作如加樣等應(yīng)在超凈臺內(nèi)進(jìn)行。

3.4擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)
該區(qū)域主要進(jìn)行的操作為擴(kuò)增片段的測定。如使用全自動封閉分析儀器檢測，此區(qū)域可不設(shè)。本區(qū)是zui主要的擴(kuò)增產(chǎn)物污染來源，因此對本區(qū)的壓力梯度的要求為：相對于鄰近區(qū)域為負(fù)壓，以避免擴(kuò)增產(chǎn)物從本區(qū)擴(kuò)散至其它區(qū)域。

4污染的預(yù)防與控制
PCR實驗室設(shè)計的核心問題是如何避免污染。在實際工作中，常見的有以下幾種污染類型：擴(kuò)增產(chǎn)物的污染；天然基因組DNA的污染；試劑的污染以及標(biāo)本間的污染。由于一旦發(fā)生污染，實驗就必須停止，直到找到污染源為止，而且實驗結(jié)果必須作廢，需重新進(jìn)行實驗。所以發(fā)生污染后再圍繞實驗室來尋找污染源不但耗時而且繁瑣，浪費人力物力。因此要避免污染，首先應(yīng)是預(yù)防，而不是排除。

4.1工作區(qū)域的嚴(yán)格劃分
（1）各個實驗區(qū)域設(shè)置合理；
（2）各個實驗區(qū)域要有明顯的標(biāo)記（如醒目的門牌或不同的地面顏色等），以避免各個不同實驗區(qū)域設(shè)備物品、試劑等發(fā)生混淆。

4.2合理的系統(tǒng)設(shè)置
（1）合理的空調(diào)通風(fēng)系統(tǒng)設(shè)置，盡量采用全送全排的空調(diào)系統(tǒng)；
（2）嚴(yán)格的氣流壓力控制，保證不同的實驗區(qū)內(nèi)不同的壓力要求。

4.3規(guī)范的操作
（1）臨床檢驗實驗室的技術(shù)人員必須進(jìn)行上崗培訓(xùn)，經(jīng)培訓(xùn)合格后才能從事臨床檢驗的工作；
（2）在實驗操作過程中，操作者必須戴手套，并經(jīng)常更換。此外，操作中使用一次性帽子也是一個有效地防止污染的措施；
（3）清潔工作及時、正確。實驗工作結(jié)束后，必須立即對本區(qū)進(jìn)行清潔。除常規(guī)的消毒液體對表面進(jìn)行擦拭消毒或紫外線燈的照射消毒外，對一些實驗設(shè)備還應(yīng)進(jìn)行高壓消毒處理。

4.4嚴(yán)格的管理
（1）嚴(yán)格控制進(jìn)出實驗室的人員。與實驗無關(guān)的人員不得隨意進(jìn)出實驗室，有條件的情況下要設(shè)置獨立的通道和進(jìn)出整個實驗區(qū)的門；
（2）在各個實驗區(qū)域使用帶有明顯區(qū)別標(biāo)志的工作服（如不同顏色），當(dāng)工作人員離開時不得將本區(qū)的工作服帶至其它區(qū)域；
（3）盡量減少在實驗區(qū)內(nèi)不必要的走動以減少交叉污染的可能性。
（4）擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)是zui主要的擴(kuò)增產(chǎn)物污染來源，廢液不能在實驗室中傾倒，必須經(jīng)消毒液浸泡消毒后在遠(yuǎn)離實驗室的地方棄掉，用過的吸頭等一次性材料也應(yīng)經(jīng)消毒液浸泡消毒后統(tǒng)一處理，如焚燒等；
（5）擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)可能會用到某些可致基因突變和有毒物質(zhì)，應(yīng)特別注意實驗人員的安全防護(hù)。

4.5完備的實驗室配套設(shè)施
完備的實驗室配套設(shè)施是保證實驗工作的必要條件，應(yīng)根據(jù)各個實驗室實驗內(nèi)容的不同配備相應(yīng)的設(shè)備和儀器，如超凈工作臺、離心機(jī)、加樣器等。

-PCR技術(shù) 
實驗原理

PCR基本原理示意圖
多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的原理類似于DNA的天然復(fù)制過程。在待擴(kuò)增的DNApian段兩側(cè)和與其兩側(cè)互補(bǔ)的兩個寡核苷酸引物，經(jīng)變性、退火和延伸若干個循環(huán)后，DNA擴(kuò)增2n倍。
1．變性：加熱使模板DNA在高溫下（94℃）變性，雙鏈間的氫鍵斷裂而形成兩條單鏈，即變性階段。
2．退火：使溶液溫度降至50－60℃，模板DNA與引物按堿基配對原則互補(bǔ)結(jié)合，即退火階段。
3．延伸：溶液反應(yīng)溫度升至72℃，耐熱DNA聚合酶以單鏈DNA為模板，在引物的引導(dǎo)下，利用反應(yīng)混合物中的4種脫氧核苷三磷酸（dNTP），按5’→3’方向復(fù)制出互補(bǔ)DNA，即引物的延伸階段。
上述3步為一個循環(huán)，即高溫變性、低溫退火、中溫延伸3個階段。從理論上講，每經(jīng)過一個循環(huán)，樣本中的DNA量應(yīng)該增加一倍，新形成的鏈又可成為新一輪循環(huán)的模板，經(jīng)過25-30個循環(huán)后DNA可擴(kuò)增106-109倍。典型的PCR反應(yīng)體系由如下組分組成：DNA模板、反應(yīng)緩沖液、dNTP、兩個合成的DNA引物、耐熱Tag聚合酶。
實驗儀器
1.PCR熱循環(huán)儀 2.移液器（0.1-2.5μL）3.PCR板
實驗試劑
1．10×緩沖液：500mmol/LKCI、100mmol/LTriS·HCI（pH8.3，室溫）、15mmol/LMgCl2
2.dNTPMix：2.5mmol/LdATP、2.5mmol/LdCTP、2.5mmol/LdGTP、2.5mmol/LdTTP
3.Tag酶5U/μL：
4.DNA模板1ng／μL：
5.引物1
6.引物2
7.引物溶液濃度2uM

實驗步驟
1．在200ulEppendorf管內(nèi)配制20ul反應(yīng)體系
2．按下述程序進(jìn)行擴(kuò)增
94℃預(yù)變性3min；94℃變性30s；58℃退火30s；72℃延伸1min30s30cycle；72℃延伸4min；4℃pause

注意事項
1．引物設(shè)計應(yīng)具有特異性，依靠引物設(shè)計軟件進(jìn)行引物設(shè)計；引物分裝成多管，不宜反復(fù)凍融多次；
2．PCR反應(yīng)的各種成份不能遺漏，操作應(yīng)戴手套，冰上操作；
3．根據(jù)引物的Tm值和擴(kuò)增片段長度以及PCR儀的特性來設(shè)定PCR循環(huán)條件；
4．注意分析電泳檢測PCR產(chǎn)物時出現(xiàn)拖帶或非特異性擴(kuò)增帶、無DNA帶或DNA帶很弱的可能原因。

-研究進(jìn)展 
PCR實驗
智能型PCR裝置在京研制成功。以聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）為基礎(chǔ)的離體技術(shù)對基因工程的研究和應(yīng)用產(chǎn)生了革命性影響。提供自動化的PCR儀器則是推廣PCR技術(shù)的關(guān)鍵。為解決國產(chǎn)PCR裝置的更新?lián)Q代并替代大量進(jìn)口，中科院發(fā)育生物學(xué)所zui近完成了以智能化儀表控制系統(tǒng)為核心的干式PCR裝置，經(jīng)多種對照引物和模板DNA的PCR實驗，獲*成功，即將通過技術(shù)鑒定并批量生產(chǎn)。該儀器的研制成功為分子生物學(xué)、生物工程、醫(yī)學(xué)和法醫(yī)學(xué)鑒定及考古、環(huán)衛(wèi)等研究和應(yīng)用部門掌握和應(yīng)用PCR技術(shù)提供了高性能價格比的新裝備。該PCR裝置采用人機(jī)對話操作方式，利用單片機(jī)小型專家系統(tǒng)，以豐富的智能化軟件取代了常規(guī)儀器的大部分硬件功能，使整機(jī)結(jié)構(gòu)大大簡化，操作方便.工作可靠，性能精良。其別具特色的實時動態(tài)運行狀態(tài)顯示、自動整定*PID參數(shù)、傳感器偏差補(bǔ)償、九組九步任意曲線串接編程、確保曲線平臺和伺服起動、多種可預(yù)設(shè)上電方式、掉電保護(hù)及報警等硬件軟化功能充分顯示了智能化儀表技術(shù)的*性。為已有的國內(nèi)外PCR裝置。
HBVC區(qū)與PCR條件的優(yōu)化
目的：為提高PCR檢測乙型肝炎病毒（HBV）的特異性和靈敏度，降低成本，對PCR條件進(jìn)行優(yōu)化。方法：將HBV特異性基因片段轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α中，提取質(zhì)粒，利用PCR擴(kuò)增HBVC區(qū)基因，對PCR條件中的退火溫度、Mg2+濃度進(jìn)行優(yōu)化，并比較3種不同TaqDNA聚合酶的靈敏度。結(jié)果：HBVC區(qū)的*退火溫度為58℃,*Mg2+濃度為1.5mmol/L，BiostarTaqDNA聚合酶擴(kuò)增到10-6。討論：對HBVC區(qū)基因進(jìn)行了轉(zhuǎn)化和PCR實驗條件的優(yōu)化，為擴(kuò)大PCR在乙型肝炎病毒（HBV）檢測領(lǐng)域中的應(yīng)用提供實驗依據(jù)。