當(dāng)目標(biāo)分析物太小而不能用兩種抗體有效地夾住時，可采用競爭性法ELISA。競爭法ELISA適用于確定小分子的濃度，如前列腺素、cAMP、一氧化氮、皮質(zhì)醇等。

該法也是將捕獲抗體包被在微孔板上。與夾心法ELISA不同的是，該法不使用標(biāo)記的檢測抗體，而是使用標(biāo)記的抗原。標(biāo)記的抗原可與樣本中的目標(biāo)抗原競爭性結(jié)合捕獲抗體。樣品中存在的抗原越多，能夠與捕獲抗體結(jié)合的標(biāo)記抗原就越少。加入底物并產(chǎn)生信號，信號值與樣品中存在的蛋白量成反比。

 

競爭法ELISA雖然適用于小分子抗原的檢測，但它也存在一些缺點：

1. 靈敏度相對較低：相比雙抗體夾心法，競爭法的靈敏度通常較低。這是因為信號強(qiáng)度與待測抗原濃度呈負(fù)相關(guān)，低濃度抗原的信號變化可能不容易被檢測到。

2. 標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍較窄：競爭法的標(biāo)準(zhǔn)曲線通常呈S形，線性范圍較窄，需要仔細(xì)優(yōu)化實驗條件才能獲得準(zhǔn)確的結(jié)果。

3. 操作較為復(fù)雜：競爭法的操作步驟相對較為復(fù)雜，需要精確控制抗原、抗體和標(biāo)記物的濃度，以及孵育時間和洗滌條件。

4. 容易受到干擾：競爭法容易受到樣本中其他物質(zhì)的干擾，如類風(fēng)濕因子、交叉反應(yīng)物質(zhì)等，這些物質(zhì)可能會影響抗原-抗體結(jié)合，導(dǎo)致結(jié)果偏差。因此，需要進(jìn)行適當(dāng)?shù)馁|(zhì)控和驗證，以確保結(jié)果的可靠性。

 

競爭法ELISA試劑盒的檢測步驟：

1. 包被抗體固定：首先，將捕獲抗體固定在微孔板上，這種抗體能特異性地結(jié)合待測抗原。

2. 加入樣品和標(biāo)記抗原：在每個微孔中加入待測樣品和已知濃度的酶標(biāo)抗原的混合液。

3. 孵育：讓樣品中的抗原與固相捕獲抗體結(jié)合，同時酶標(biāo)抗原也在競爭結(jié)合這些位點。

4. 洗滌：去除未結(jié)合的抗原和酶標(biāo)抗原，以減少背景信號。

5. 加入酶標(biāo)二抗（如果適用）：在一些競爭法中，可能需要加入酶標(biāo)二抗來檢測結(jié)合的酶標(biāo)抗原。

6. 第二次洗滌：進(jìn)一步清除未結(jié)合的酶標(biāo)二抗，保持高特異性。

7. 顯色底物：加入酶的底物，形成顏色變化或熒光信號。

8. 讀取結(jié)果：通過酶標(biāo)儀在特定波長下讀取吸光度值，通常在450nm。樣品中待測抗原的濃度與信號強(qiáng)度呈反比。

9. 建立標(biāo)準(zhǔn)曲線：使用已知濃度的標(biāo)本建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，以量化樣品中的待測抗原。

通過這些步驟，競爭法ELISA可以有效地區(qū)分樣品中抗原的濃度，即使在復(fù)雜或低純度的樣本中也能得到可靠的定量結(jié)果。