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有高特異性和高精度的胞嘧啶堿基編輯器
點(diǎn)擊次數(shù)：1134 發(fā)布時(shí)間：2020-8-28
在一項(xiàng)新的研究中，高彩霞教授課題組基于截短的人APOBEC3胞嘧啶脫氨酶（A3Bctd）構(gòu)建出兩種新的CBE，并開(kāi)發(fā)出一種高通量檢測(cè)方法，用于評(píng)估植物CBE中不依賴于單向?qū)NA（sgRNA）的脫氨變化。
他們首先開(kāi)發(fā)了一種快速、高通量且廉價(jià)的方法---nSaCas9介導(dǎo)的正交R環(huán)測(cè)定法---來(lái)評(píng)估植物中的CBE。在這種測(cè)定法中，正交CRISPR系統(tǒng)nSaCas9被用于在植物細(xì)胞中產(chǎn)生單鏈DNA（ssDNA）區(qū)域，作為不依賴于sgRNA的脫氨變化的靶標(biāo)。為了評(píng)估nSaCas9介導(dǎo)的正交R環(huán)測(cè)定，他們將它與全基因組測(cè)序（WGS）測(cè)定進(jìn)行了比較。
一致性的結(jié)果表明，nSaCas9介導(dǎo)的正交R-loop測(cè)定法為評(píng)估CBE的不依賴于sgRNA的脫靶活性提供了一種合理、快速和高通量的方法。
他們隨后通過(guò)合理設(shè)計(jì)構(gòu)建出16個(gè)A3Bctd脫氨酶變體，并評(píng)估了它們的在靶效率（on-target efficiency）和不依賴于sgRNA的脫靶活性。他們利用nSaCas9介導(dǎo)的正交R環(huán)測(cè)定法對(duì)這些A3Bctd-BE3變體進(jìn)行了測(cè)試，并選擇了7個(gè)與高效的在靶編輯活性和下降的脫靶活性相關(guān)的突變。之后，他們將這些突變進(jìn)行組合，產(chǎn)生了9個(gè)新的具有雙氨基酸或三氨基酸替換的A3Bctd-BE3變體。
通過(guò)這種方式，他們得到了兩個(gè)新的CBE變體：A3Bctd-VHM-BE3和A3Bctd-KKR-BE3，這兩個(gè)變體表現(xiàn)出高效的在靶活性和明顯下降的不依賴于sgRNA的脫靶活性。
此外，這兩種新的CBE變體在它們的靶位點(diǎn)上的編輯表現(xiàn)得更，主要產(chǎn)生單個(gè)和兩個(gè)胞嘧啶（C）編輯。他們還通過(guò)全基因組測(cè)序驗(yàn)證了A3Bctd-VHM-BE3和A3Bctd-KKR-BE3的高特異性