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細菌質粒的制備（:堿裂解法、煮沸法和小量一步提取法）
最近更新時間：2015-11-10
提 供 商：上海士鋒生物科技有限公司資料大小：53.4KB
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質粒是染色體外的能獨立遺傳的共價閉合雙鏈DNA分子，它存在于細菌和其它一些生物體內，能夠提供給宿主細胞一些表型如抗藥性，分解復雜有機物的能力。野生質粒經過改造后可以作為基因工程的載體，這種質粒載體在基因工程中具有極廣泛的應用價值。因此質粒的分離與提取是分子生物學zui常用、zui基本的實驗技術之一。
細菌質粒是zui常用的基因工程載體，它的提取可以分為以下三步：細菌培養(yǎng)物的生長，細菌的收集和裂解，質粒DNA的純化。細菌培養(yǎng)物是通過在含有適當濃度的抗生素的液體培養(yǎng)基中接種一含有所提質粒的宿主菌的單菌落，37℃,150-250rpm搖培獲得的。對松弛型的質粒，可以在細菌生長的對數后期加入氯霉素抑制宿主菌蛋白的合成和染色體dna的復制來增加拷貝數。但目前所用的質粒載體如pUC系列，采用強的改進型的pMB1復制子，拷貝數能達到幾百個，因此不用進行后期的氯霉素處理即可獲得高產量的質粒。細菌的收集可以采用離心的方法，為了防止細菌排除的代謝廢物影響質粒的純度可以用液體培養(yǎng)基或生理鹽水洗1-2次。細胞裂解的方法很多，如去污劑法，煮沸法，堿變性法等。這些方法各有利弊，要根據質粒的性質，宿主菌的特性及后續(xù)的純化方法等多種因素加以選擇。粗提質粒為了滿足一些實驗的要求還需要進一步純化， 氯化銫-溴化乙錠密度梯度離心純化質粒DNA是可靠經典的方法。
細菌質粒的提取常采用堿裂解法，煮沸法，一步提取法以及在堿裂解法基礎上的試劑盒法等。
堿裂解法利用宿主菌線狀染色體DNA與閉環(huán)雙鏈質粒DNA的結構狀態(tài)的差異來提取質粒DNA。當同時堿變性時，線狀基因組DNA變性充分而質粒DNA處于拓撲纏繞的自然狀態(tài)而不能彼此分開。當條件恢復時（酸中和），質粒DNA迅速準確配置重新形成*天然超螺旋分子，而線狀DNA則與破裂的細胞壁，細菌蛋白相互纏繞成大型復合物，被SDS包蓋。當K+取代Na+時這些復合物會從溶液中沉淀下來，附在細胞碎片上一起被離心除去。
煮沸法利用高溫破壞細菌細胞，同時利用溶菌酶酶解細菌細胞。把細菌懸浮于含有Triton X－100、溶菌酶（消化細胞壁）的緩沖液中，然后加熱到100℃，使其裂解。加熱破壞了細胞壁，還有助于解開DNA鏈的堿基對，并使蛋白質和染色體DNA變性。但是閉環(huán)質粒dna配對雖被破壞，但是鏈彼此不會分離，當溫度下降恢復成超螺旋。離心除去變性的染色體DNA和蛋白質，從上清液中回收質粒DNA。小量一步提取法是直接將細菌培養(yǎng)物和酚/氯仿混合，同時完成細胞裂解、蛋白變性兩個過程，然后離心除去大部分細胞核DNA與蛋白質，含質粒DNA的上清用異丙醇沉淀。其優(yōu)點是操作簡單、方便、經濟，特別適合大量質粒的快速分析。
多數公司生產的商品化的質粒提取試劑盒多采用在堿裂解法的基礎上通過特殊的吸附柱來純化質粒DNA 的方法。經堿裂解獲得的含質粒的上清液和高鹽的結合緩沖液混合后，加到能、專一吸附DNA的特殊硅基質填充的離心吸附柱子中，再用洗滌緩沖液通過離心洗去蛋白、鹽等雜質，zui后用洗脫緩沖液將質粒DNA洗脫下來。在提取液中含有RNaseA，可以在提取純化過程中除去RNA,而不用另外單獨加RNaseA除去RNA,。該方法由于不用苯酚、氯仿抽提，減少了對質粒DNA破壞，而且純度很高，超螺旋結構占80-90%。
1.1. 堿裂解法
一、材料、試劑和儀器
1．材料 含有質粒的菌種
2．試劑
溶液I：
注：也可以用3M KAc代替，但效果不好。