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聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)及其產(chǎn)物分析
最近更新時(shí)間：2016-5-18
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實(shí)驗(yàn)?zāi)康模菏煜CR反應(yīng)的原理；掌握PCR反應(yīng)的操作步驟以及PCR反應(yīng)參數(shù)的選擇與優(yōu)化；掌握PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)方法。
實(shí)驗(yàn)原理：PCR擴(kuò)增是模擬天然DNA復(fù)制過(guò)程，利用dna聚合酶在體外（試管中）擴(kuò)增一對(duì)引物之間特異性DNA片段的方法。其主要熱循環(huán)過(guò)程可分為三個(gè)步驟：
（1）高溫變性（deNature）：提供DNA復(fù)制的有效模板。
（2）低溫退火（anneal）：引物與模板DNA復(fù)性，提供游離3’-OH端供DNA復(fù)制起始；
（3）中溫延伸（extend）：依賴Mg2+，DNA聚合酶催化合成與模板互補(bǔ)的新的DNA分子。
以上變性、退火、延伸三個(gè)過(guò)程組成一個(gè)循環(huán)周期；常循環(huán)25～40周期，經(jīng)過(guò)n輪循環(huán)后，靶DNA的拷貝數(shù)理論上呈2n增長(zhǎng)；循環(huán)進(jìn)行完畢，通常zui后還在DNA聚合酶zui適溫度下延伸5～10分鐘。
操作步驟：本次實(shí)驗(yàn)程序如下：
（1）標(biāo)記一個(gè)潔凈的200uL反應(yīng)管，向其中依次加入：
ddH2O 36 uL
10×pcr反應(yīng)緩沖液 5uL
2mmol/L dNTPs 5uL
上游引物 1uL
下游引物 1uL
DNA模板 1uL
Taq DNA聚合酶 1 uL
總體積：50uL
混合均勻后，蓋緊管蓋，離心5S，使反應(yīng)成份均勻富集于管底。
（2） 加石蠟油50～100μl于反應(yīng)液表面以防蒸發(fā)（此步驟根據(jù)PCR儀而定，如帶高溫?zé)嵘wPCR儀不需加入）。
（3） 在PCR儀上設(shè)置反應(yīng)循環(huán)參數(shù)，本次實(shí)驗(yàn)為：94℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 30s，循環(huán)數(shù)為30，zui后于72℃充分延伸10 min后終止反應(yīng)（16℃ 3 min）。
（4） 置反應(yīng)管于PCR儀上進(jìn)行熱循環(huán)。
（5） 反應(yīng)完畢后，常取5～10％反應(yīng)產(chǎn)物（如本次5uL）進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，通過(guò)溴乙錠染色，在紫外燈下觀察擴(kuò)增產(chǎn)物的質(zhì)量，正常DNA電泳帶應(yīng)清晰、整齊，并通過(guò)與已知分子量大小的DNA標(biāo)志物比較，初步了解產(chǎn)物大小是否與預(yù)期吻合。
注意事項(xiàng)：
1. 戴手套操作，避免污染
2．冰上操作