上海北諾生物科技有限公司

中級(jí)會(huì)員·14年

聯(lián)系電話

15800960770

您現(xiàn)在的位置: 首頁> 技術(shù)文章 > PCR技術(shù)專題:PCR-SSCP 技術(shù)實(shí)驗(yàn)
中級(jí)會(huì)員·14年
聯(lián)人:
周經(jīng)理 劉經(jīng)理
話:
021-57730393
機(jī):
15800960770
真:
86-021-61496710
址:
上海市徐匯區(qū)宜山路520號(hào)中華門大廈18樓D座
個(gè)化:
www.bnbiotech.com
網(wǎng)址:
www.bnbiotech.com

掃一掃訪問手機(jī)商鋪

PCR技術(shù)專題:PCR-SSCP 技術(shù)實(shí)驗(yàn)

2013-11-14  閱讀(944)

分享:

實(shí)驗(yàn)原理

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-單鏈構(gòu)象多態(tài)(Polymerase Chain Reaction-Single Strand Conformation Polymorphism,PCR-SSCP)技術(shù)是在PCR技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的,它是一種簡單、快速、經(jīng)濟(jì)的用來顯示在PCR反應(yīng)產(chǎn)物中單堿基突變(點(diǎn)突變)的手段。該方法已被用做癌基因和抑癌基因突變的篩查檢測,遺傳病的致病基因分析和基因診斷,基因制圖等領(lǐng)域。

在SSCP測定中,雙鏈DNA(dsDNA)被變性成為單鏈DNA(ssDNA),每一條單鏈DNA都基于它們的內(nèi)部序列而呈現(xiàn)出一種*的折疊構(gòu)象,即使同樣長度的DNA單鏈因其堿基順序不同、甚至單個(gè)堿基的不同會(huì)形成不同的構(gòu)象。這些單鏈DNA在非變性條件下,用非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離,單鏈DNA的遷移率和帶型,都取決于其折疊構(gòu)象和電泳時(shí)的溫度。

試劑與材料

1.樣本DNA(100 ng/ml)、MTHFR上下游引物(5 pmol/ml)、Taq DNA聚合酶(5 U/ml)、10×PCR反應(yīng)緩沖液、4×dNTPs(2.5 mmol/L)、30%丙烯酰胺(交聯(lián)度49:1)、5×TBE緩沖液、10%過硫酸銨(現(xiàn)用現(xiàn)配)、TEMED、甲酰胺上樣緩沖液、固定液、銀染液、顯色液。

2.微量加樣器、PCR自動(dòng)熱循環(huán)儀、聚丙烯酰胺凝膠電泳裝置。

實(shí)驗(yàn)步驟

一、PCR反應(yīng)

20 ml反應(yīng)體系成分如下:

模板DNA(100 ng/ml)        1 ml

10×PCR反應(yīng)緩沖液           2 ml

Taq DNA聚合酶(5 U/ml)   0.2 ml

4×dNTPs(2.5 mmol/L)      1 ml

MTHFR上下游引物          各 1 ml

ddH2O 加至終體積           20 ml

PCR反應(yīng)循環(huán)參數(shù):

95℃ 5 min;

94℃ 30 s、62℃ 50 s、72℃ 90 s,共30個(gè)循環(huán);

72℃ 7 min。

反應(yīng)結(jié)束后,置4℃保存。

二、非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳

1.制備6%的非變性聚丙烯酰胺凝膠:30%聚丙烯酰胺(交聯(lián)度49:1)10 ml,5×TBE緩沖液10 ml,加蒸餾水至50 ml,加TEMED 25 ml、10%過硫酸銨250 ml,混勻后灌膠,插入加樣梳子。待膠*聚合后,拔出加樣梳子,安裝電泳裝置,加入電泳緩沖液(1×TBE),緩沖液應(yīng)高于加樣孔上緣,用注射器吸取緩沖液沖凈加樣孔。

2.取5 ml 擴(kuò)增產(chǎn)物加10 ml變性上樣緩沖液混勻,98℃變性10 min,迅速冰浴。

3.取5 ml混合液加到點(diǎn)樣孔中,以1~8 V/cm電泳4~5 h。

三、聚丙烯酰胺凝膠染色

1.拆下電泳裝置,取出聚丙烯酰胺凝膠,放到一個(gè)塑料盤內(nèi),用蒸餾水沖洗1~2遍。

2.倒入固定液,固定8~10 min。

3.用蒸餾水沖洗1~2遍;倒入銀染液,銀染10~12 min。

4.用蒸餾水沖洗若干遍;倒入顯色液,顯色至出現(xiàn)清晰的銀染帶。

5.用蒸餾水浸泡聚丙烯酰胺凝膠,觀察PCR-SSCP結(jié)果。

結(jié)果判斷

觀察并記錄聚丙烯酰胺凝膠上的DNA單鏈帶,根據(jù)異常泳動(dòng)變位篩查突變樣本。

應(yīng)用

在遺傳學(xué)方面的有廣泛的應(yīng)用,例如,癌基因或抑癌基因的基因突變的篩查,遺傳病的致病基因的突變篩查和基因診斷等。

注意事項(xiàng)

1.靶DNA序列長度不宜過長,否則靈敏度下降。

2.DNA樣品在電場中泳動(dòng)的長度一般要求在16~18 cm以上。

3.染色在塑料盤中進(jìn)行。

會(huì)員登錄

×

請輸入賬號(hào)

請輸入密碼

=

請輸驗(yàn)證碼

收藏該商鋪

X
該信息已收藏!
標(biāo)簽:
保存成功

(空格分隔,最多3個(gè),單個(gè)標(biāo)簽最多10個(gè)字符)

常用:

提示

X
您的留言已提交成功!我們將在第一時(shí)間回復(fù)您~
產(chǎn)品對比 二維碼 在線交流

掃一掃訪問手機(jī)商鋪

對比框

在線留言