H7亞型禽流感病毒單克隆抗體的如何制備及ELISA診斷方法的建立

研究采用高致病性禽流感病毒（Highly pathogenic avian influenza virus，HPAIV）A／FPV／Rostock／34（H7N1）（FPV）毒株作為免疫原，免疫8周齡BALB／C雌性小鼠，三次加強(qiáng)免疫后取脾細(xì)胞與SP2／0細(xì)胞融合，用血凝抑制試驗(yàn)（HI）方法檢測(cè)篩選，陽(yáng)性細(xì)胞克隆經(jīng)有限稀釋法克隆培養(yǎng)，zui后獲得兩株H7亞型HA特異性單抗6H4和7F6，亞類分別為IgG2a、IgG2b，輕鏈都為k鏈，經(jīng)檢測(cè)具有良好的特異性。采用純化的HPAIV A／FPV／Rostock／34（H7N1）（FPV）毒株作為免疫原，滅活后加入弗氏*佐劑和不*佐劑制成疫苗多次免疫山羊，獲得抗H7亞型禽流感的高免羊血清。 用羊血清作為捕獲抗體，H7亞型特異性單克隆抗體為檢測(cè)抗體，建立了檢測(cè)H7亞型高致病性禽流感病毒的雙抗體夾心ELISA方法。通過對(duì)各步反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，獲得的*工作條件為：羊血清1：1000倍稀釋，單抗1：40000稀釋，酶標(biāo)抗體為1：5000倍稀釋，一抗反應(yīng)時(shí)間1.5h，酶標(biāo)抗體作用時(shí)間1.5h。 用建立的抗原捕捉ELISA方法對(duì)已知的NDV、EDS76、IBV、IBDV、ILTV、MDV和APV等禽類病毒以及其他15個(gè)HA亞型禽流感標(biāo)準(zhǔn)病毒株進(jìn)行交叉反應(yīng)性試驗(yàn)，結(jié)果表明：建立的H7亞型高致病性禽流感抗原捕捉ELISA方法和其他禽類病毒以及其他亞型禽流感病毒均沒有明顯的交叉反應(yīng)性，說明該方法對(duì)H7亞型高致病性禽流感病毒具有很好的特異性。 與血凝試驗(yàn)（HA）和雞胚接種試驗(yàn)相比，本實(shí)驗(yàn)建立的抗原捕獲ELISA方法較HA敏感2倍以上，但不如雞胚接種試驗(yàn)敏感。 利用優(yōu)化的ELISA反應(yīng)條件對(duì)人工感染的研究樣本進(jìn)行檢測(cè)，通過對(duì)脾臟、腎臟、心臟、肺臟等多份陰陽(yáng)性樣本的檢測(cè)zui終確定以心臟作為研究檢測(cè)的靶器官，并將0.099（OD_（490nm））作為臟器的陰陽(yáng)性判定標(biāo)準(zhǔn)。 將試驗(yàn)用的各種試劑及包被的反應(yīng)板組裝成試劑盒，同時(shí)保存于室溫、4℃和-20℃，定期進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明：試劑盒在室溫保存時(shí)極不穩(wěn)定，保存期限很短，4℃和-20℃條件下都可以保存3個(gè)月以上。