LNPs（Lipid Nanoparticles，脂質(zhì)納米顆粒）因在COVID-19 mRNA疫苗中成功發(fā)揮作用，有效地保護(hù)和運(yùn)輸mRNA到細(xì)胞而聞名。然而，我們需要徹底理解這些系統(tǒng)的生物物理特性，以確保它們的安全性、穩(wěn)定性和有效性，并確保監(jiān)管部門的批準(zhǔn)。動(dòng)態(tài)光散射(DLS)是一種公認(rèn)的工具，可以通過提供粒徑和聚集形成的信息來幫助LNPs的生物物理表征。多角度動(dòng)態(tài)光散射(MADLS)則更進(jìn)了一步：傳統(tǒng)的單角度背向散射只能提供粒徑信息，而多角度檢測(cè)可以產(chǎn)生更高分辨率的粒徑分布(PSD)和顆粒濃度數(shù)據(jù)。

什么是脂質(zhì)納米顆粒?

LNP通常呈球形，由脂質(zhì)核心基質(zhì)組成，脂質(zhì)核心基質(zhì)本身通常由可電離的離子脂質(zhì)、聚乙二醇化脂質(zhì)和膽固醇組成 (圖1)。這些都有助于在不同的生物環(huán)境中穩(wěn)定和保護(hù)LNP——這一點(diǎn)很重要，因?yàn)樽鳛樗幬镞f送載體，LNP可以運(yùn)輸疏水或親水分子，包括小分子、蛋白質(zhì)和核酸[2]。當(dāng)然，我們了解它們物理特性的能力對(duì)于獲得監(jiān)管機(jī)構(gòu)的批準(zhǔn)至關(guān)重要。

圖1 本研究表征的mRNA-LNP的基本結(jié)構(gòu)和組成示意圖

LNP的兩個(gè)重要物理屬性是粒徑分布(PSD)和多分散性。DLS測(cè)量顆粒在單角度(通常為背散射或側(cè)散射角)進(jìn)行布朗運(yùn)動(dòng)時(shí)散射強(qiáng)度的波動(dòng)，通過使用累積量或非負(fù)最小二乘法(NNLS)分析波動(dòng)，DLS數(shù)據(jù)提供了樣本內(nèi)平均直徑(Z-average)、多分散性指數(shù)(PdI)或PSD的信息。觀察平均粒徑(Z-average)和多分散性指數(shù)(PdI)的變化是監(jiān)測(cè)LNP制劑穩(wěn)定性的常用方法。

MADLS是一種比單角度DLS更高級(jí)的選擇，它使用三個(gè)不同的檢測(cè)角度（前向、側(cè)向和背向）進(jìn)行PSD測(cè)量，該測(cè)量考慮了角度相關(guān)的散射信息，因此可以在包含多種尺寸種群的樣品中獲得更高分辨率的粒度分布(PSD)圖像。此外，MADLS允許我們計(jì)算樣品中每個(gè)種群的總顆粒濃度[3]。

本研究使用了兩種mRNA-LNP配方: LNP1和LNP2。動(dòng)態(tài)光散射(DLS)和多角度動(dòng)態(tài)光散射(MADLS)的測(cè)量使用馬爾文帕納科Zetasizer Ultra納米粒度及電位分析儀，使用波長(zhǎng)為632.8 nm的He-Ne氣體激光器，最大功率為10 mW。單角度DLS數(shù)據(jù)來自MADLS測(cè)量，因?yàn)樗菧y(cè)量的三個(gè)角度之一，并且您可以查看測(cè)量中的所有角度數(shù)據(jù)。單角度DLS數(shù)據(jù) (NIBS，圖2，藍(lán)色) ，并與MADLS測(cè)量中所有三個(gè)角度的組合結(jié)果 (圖2，紅色) 一起繪制。使用背向散射檢測(cè)和小體積石英樣品池 (ZEN2112 Malvern Panalytical)，對(duì)每個(gè)樣品進(jìn)行了5次重復(fù)測(cè)量。由于系統(tǒng)集成了ZS XPLORER軟件，儀器設(shè)置可以自動(dòng)優(yōu)化。

圖2 使用Zetasizer Ultra通過NIBS（藍(lán)色）和MADLS（紅色）測(cè)量的mRNA LNP制劑（LNP 1，A；LNP 2，B）的強(qiáng)度加權(quán)PSD。

對(duì)于LNP 1，使用DLS獲得的PSD顯示了樣品內(nèi)的兩個(gè)粒子群 (圖2 A)。相比之下，與傳統(tǒng)NIBS相比，MADLS具有更高的PSD尺寸分辨率，可以識(shí)別出PSD中的三個(gè)不同峰。此外，對(duì)于LNP 2, DLS顯示了一個(gè)由寬峰代表的單一種群，而MADLS則識(shí)別了一個(gè)較大聚集體的小種群 (圖2 B)。已知這些較大的聚集體會(huì)使得背散射DLS數(shù)據(jù)變寬。

與此同時(shí)，多分散系數(shù)PDI值可以與平均粒徑結(jié)合使用來描述聚合體或團(tuán)聚體的存在。查看PdI和%Pd可以揭示LNP1和LNP2在多分散性上的差異。在這種情況下，被認(rèn)為是單分散體系的指標(biāo)是%Pd小于20%，PdI為± 0.13。

表1通過DLS測(cè)定mRNA LNP制劑的多分散性

在本次測(cè)試中，我們可以看到LNP1是一個(gè)比LNP2更分散的樣本 (表1)。從MADLS數(shù)據(jù)中可以明顯看出PSD差異 （圖2；紅色），讓我們清楚地了解樣本中多個(gè)種群的存在，并顯示較大聚集體的峰值。

這是一個(gè)很好的例子，說明MADLS和DLS如何作為預(yù)篩選指標(biāo)發(fā)揮重要作用，以確定樣本內(nèi)聚集體的PSD。MADLS還允許我們測(cè)量~109和~1012個(gè)顆粒/mL之間的顆粒濃度-這擴(kuò)展了其他技術(shù)的濃度范圍，如納米顆粒跟蹤分析(NTA[4])3 -并且可以在廣泛的濃度范圍內(nèi)提供顆粒濃度的正交測(cè)量。考慮到DLS和MADLS通常用于快速測(cè)定粒度、多分散性和/或濃度，該功能對(duì)于LNP的開發(fā)很重要，因?yàn)樗梢詭椭u(píng)估配方或處理步驟對(duì)樣品穩(wěn)定性的影響。

03丨結(jié)果討論

評(píng)估物理特性，如粒徑分布和顆粒濃度，是有效開發(fā)LNP作為藥物遞送載體的關(guān)鍵。從這項(xiàng)研究中，我們可以看到DLS和MADLS等技術(shù)的價(jià)值，它們可以深入了解樣本的潛在不穩(wěn)定性，例如，隨著時(shí)間的推移，聚集形成的情況 (參見表2，對(duì)可測(cè)量屬性和相關(guān)參數(shù)的概述)。

表2 DLS和MADLS測(cè)量的樣本屬性，以及相應(yīng)的測(cè)量參數(shù)和所需的樣本信息

這兩種方法也經(jīng)常用于了解從一個(gè)批次到另一個(gè)批次的一致性。DLS和MADLS都可以覆蓋很寬的粒徑范圍 (~1 nm到10 μm)，這使它們比其他技術(shù)具有優(yōu)勢(shì)。一方面，DLS更適合于多分散性相對(duì)較低的樣品，其中可能存在另一種較大的顆粒。與此同時(shí)，MADLS使用多角度檢測(cè)來提供更高的PSD分辨率，從而提供有關(guān)樣本內(nèi)潛在種群的更多信息。

雖然MADLS也可以作為一種篩選工具，用于檢測(cè)樣本中存在的較大聚集體的小種群 (見圖2B)，但它不能分辨大小差異小于2:1 (DLS為3:1)的小群體。然而，它可以用作其他顆粒濃度測(cè)量技術(shù)的正交驗(yàn)證 (例如，納米顆粒跟蹤分析(NTA)，酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定 (ELISA)等)。

參考文獻(xiàn)：

[1] Markova, N.; Cairns, S.; Jankevics-Jones, H.; Kaszuba, M.; Caputo, F.; Parot, J., Biophysical Characterization of Viral and Lipid-Based Vectors for Vaccines and Therapeutics with Light Scattering and Calorimetric Techniques. Vaccines (Basel) 2021, 10 (1).

[2] Tenchov, R.; Bird, R.; Curtze, A. E.; Zhou, Q., Lipid Nanoparticles─From Liposomes to mRNA Vaccine Delivery, a Landscape of Research Diversity and Advancement. ACS Nano 2021, 15 (11), 16982-17015.

[3] Austin, J.; Minelli, C.; Hamilton, D.; Wywijas, M.; Jones, H. J., Nanoparticle number concentration measurements by multi-angle dynamic light scattering. Journal of Nanoparticle Research 2020, 22 (5), 108.

[4] N. Markova, et al. Vaccines 10, 49 (2022).