本試劑盒應用雙抗體夾心法測定標本中植物羥基自由基水平。用純化的植物羥基自由基抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入植物羥基自由基，再與HRP標記的羥基自由基抗體結合，形成抗體-抗原-酶標抗體復合物，經過*洗滌后加底物TMB顯色。

 

　　TMB在HRP酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成黃色。顏色的深淺和樣品中的植物羥基自由基呈正相關。

 

　　用酶標儀測定吸光度，通過標準曲線計算樣品中植物羥基自由基濃度。

 

　　植物ELISA試劑盒的實驗操作步驟如下：

　　1、標準品的稀釋：本試劑盒提供原倍標準品一支，用戶可按照圖表在小試管中進行稀釋。

 

　　2、加樣：分別設空白孔、標準孔、待測樣品孔，加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。

 

　　3、溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。

 

　　4、配液：將30倍濃縮洗滌液用蒸餾水30倍稀釋后備用。

 

　　5、洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復5次，拍干。

 

　　6、加酶：每孔加入酶標試劑，空白孔除外。

 

　　7、溫育：操作同3。

 

　　8、洗滌：操作同5。

 

　　9、顯色：每孔先加入顯色劑，再加入顯色劑B，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15分鐘。

 

　　10、終止：每孔加終止液，終止反應（此時藍色立轉黃色）。

 

　　11、測定：以空白空調零，依序測量各孔的吸光度（OD值），測定應在加終止液后15分鐘以內進行。