大鼠elisa檢測試劑盒制取質(zhì)粒的過程

      大鼠elisa檢測試劑盒我們知道，質(zhì)粒是攜帶外源基因進(jìn)入細(xì)菌中擴增或表達(dá)的主要載體，它在基因操作中具有重要作用。分離與提取是zui常用、zui基本的實驗技術(shù)。

     它的制取方法有很多的，一般情況下來，大多都是包括了細(xì)菌的培養(yǎng)、細(xì)菌的收集和裂解、質(zhì)粒DNA的分離和純化這三個步驟。而今天給朋友們講說的實驗中，是以以堿裂解法為例，其中，我們要掌握堿裂解法抽提質(zhì)粒的原理、步驟及各試劑的作用。 

    所需物品：
1、含有質(zhì)粒pUC18載體的大腸桿菌菌液
2、克隆有水稻外源片段的BAC的大腸桿菌菌液 
    取過程
1、取含有pUC18質(zhì)粒的大腸桿菌菌液于LA培養(yǎng)基上37℃過一個晚上培養(yǎng)； 
2、用無菌牙簽挑取單菌落，接種于含有Amp抗生素的LB培養(yǎng)基中，37℃搖床~250 r/min過一個晚上培養(yǎng)； 
3、吸取1.5 ml菌液，12000 g離心2分鐘，收集菌體，倒掉菌液；吸取1.5 ml菌液，再次收集菌體，盡量將菌液倒干凈； 
4、加入300 ml溶液 I振蕩打勻,重新懸浮細(xì)胞，震蕩混勻（這里的時候，上海恒遠(yuǎn)提醒注意：應(yīng)*打勻沉淀或碎塊）；
5、加入300 ml溶液II，輕柔顛倒混勻，放置至清亮，一般不超過5分鐘； 
6、加入300 ml溶液III顛倒混勻，放置于冰上10分鐘，使雜質(zhì)充分沉淀； 
7、12000 g離心10分鐘； 
8、吸取800 ml上清液（注意！不要吸取到飄浮的雜質(zhì)）至另一Eppendorf管中，加入2/3體積的異丙醇，室溫下放置5分鐘； 
9、12000 g 常溫離心15分鐘； 
10、倒盡上清，加75％乙醇浸洗除鹽（放置片刻或離心3分鐘后倒去上清）； 
11、室溫放置或超凈臺上風(fēng)干DNA； 
12、加40 ml滅菌超純水或TE溶解； 
13、質(zhì)粒、BAC的質(zhì)量檢測，于-20℃保存. 

      我們這個實驗的主要原理依據(jù)是在pH 12.0 ~ 12.6堿性環(huán)境中，細(xì)菌的線性大分子量染色體DNA變性分開，而共價閉環(huán)的質(zhì)粒DNA雖然變性但仍處于拓?fù)淅p繞狀態(tài)。將pH調(diào)至中性并有高鹽存在及低溫的條件下，大部分染色體DNA、大分子量的RNA和蛋白質(zhì)在去污劑SDS的作用下形成沉淀，而質(zhì)粒DNA仍然為可溶狀態(tài).通過離心，可除去大部分細(xì)胞碎片、染色體DNA、RNA及蛋白質(zhì)，質(zhì)粒DNA尚在上清中，然后用酚抽提進(jìn)一步純化質(zhì)粒DNA。