TUNEL細胞凋亡試劑盒(綠色熒光)

一、實驗材料（自備）
PBS 緩沖液（1×，pH~7.4）
0.4% Triton X-100（PBS 配制） 
0.1% Triton X-100（PBS 配制，其中含 5 mg/mL BSA）
4%多聚甲醛（PBS 配制）
免疫組化筆
脫蠟溶劑（石蠟切片樣本）
石蠟切片處理相關(guān)試劑
抗熒光淬滅封片劑
ddH2O
二、實驗設(shè)計
A.陽性對照：
DNase I 處理制備陽性對照載玻片。DNase I可以消化單鏈或雙鏈DNA暴露3'-OH末端，人為造成細胞凋亡。每次實驗做一次即可。（用來驗證本次實驗操作和試劑盒有無問題）
B.陰性對照：
使用不含TdT Enzyme的TUNEL Reaction Buffer，用ddH2O替代 TdT Enzyme。（主要是排除細胞自身凋亡、操作過程等原因?qū)е碌姆翘禺愋匀旧灰约罢{(diào)整拍攝曝光強度。）
C.實驗處理組。
實驗組按照說明書正常操作。
D.實驗對照組。
實驗組按照說明書正常操作。
三、實驗步驟:
1、樣本準備：
（1）對于貼壁細胞或細胞涂片
a. PBS 清洗 1 次。
注：如果擔心細胞涂片的細胞貼得不牢，可以干燥樣品使細胞貼得更牢。
b. 固定：加入適量 4%多聚甲醛（PBS 配制），4°C固定 30 min。PBS 清洗 2 次。
c. 通透：加入適量0.4% Triton X-100（PBS配制），室溫通透20 min。PBS清洗2次。
d.轉(zhuǎn)步驟 2. TUNEL 反應(yīng)。

（2）對于懸浮細胞或細胞懸液
a. 收集細胞（ 3-5×106個細胞），1000 rpm離心5 min，PBS清洗2次。 
b. 固定：加入適量4%多聚甲醛（PBS配制）充分重懸細胞，4℃固定30 min。2000 rpm離心5 min，PBS清洗2次。 
c. 通透：加入適量0.4% Triton X-100（PBS 配制），室溫通透20 min。2000 rpm離心5 min，PBS清洗2次。 
d. 轉(zhuǎn)步驟2. TUNEL 反應(yīng)。 

（3）石蠟組織切片
a. 將石蠟切片置于切片架上，放置于60℃烘箱中烤片60min。 
b. 脫蠟與水化：將切片樣本依次放入二甲苯I（10 min）→ 二甲苯II（10 min）→ 100％乙醇I（5 min）→ 100％乙醇II（5 min）→ 95%乙醇（5 min）→ 90%乙醇（5 min）→ 80%乙醇（5 min）→ 70%乙醇（5 min）→ ddH2O沖洗5 min，沖洗2次。 
注：二甲苯有毒，易揮發(fā)，請在通風櫥中進行此操作。 
c. 用濾紙吸干切片樣本周圍液體，用免疫組化筆圈好樣本輪廓，以便下游通透與標記。 
注：若在后續(xù)實驗操作中發(fā)現(xiàn)免疫組化筆畫的輪廓圈被破壞，需及時補畫。 
d. 通透：按1: 50 的比例，將2 mg/mL的Proteinase K 溶液用PBS稀釋至終濃度40 µg/mL，在每個樣本上滴加100 µL，使溶液覆蓋全部樣本區(qū)域，37℃孵育30 min。 
注：Proteinase K 可通透細胞膜和核膜，從而使后續(xù)步驟的染色試劑充分進入細胞核進行反應(yīng)，提高標記效率。孵育時間過長會增加組織切片在后續(xù)洗滌步驟中從載波片上脫落的風險，過短則可能造成透性處理不充分，影響標記效率。為得到更好的結(jié)果，Proteinase K 的濃度、孵育時間、溫度需根據(jù)不同類型組織樣本進行優(yōu)化。 
e. 將切片樣本浸入 1×PBS 漂洗三次，每次5 min，用濾紙吸去多余的液體，將處理好的樣本放在濕盒中保持濕潤。 
注：這一步必須把Proteinase K洗滌干凈，否則會嚴重干擾后續(xù)的標記反應(yīng)。 
f. 轉(zhuǎn)步驟2. TUNEL 反應(yīng)。 

（4）冰凍組織切片
a. 固定：取出冰凍切片，并回溫至室溫。將切片樣本浸入4%多聚甲醛（PBS配制）中，室溫固定30 min。將切片樣本浸入 1×PBS 漂洗三次，每次10 min。 
注：若是擔心甲醛清洗不干凈，影響最終染色效果?？稍诩兹┕潭ㄍ瓿珊蠹尤脒m量2 mg/mL 甘氨suan清洗 10 min，中和殘留的固定液，再進行PBS清洗。 
b. 用濾紙吸干切片樣本周圍液體，用免疫組化筆圈好樣本輪廓，以便下游通透與標記。 
注：若在后續(xù)實驗操作中發(fā)現(xiàn)免疫組化筆畫的輪廓圈被破壞，需及時補畫。 
c. 通透：按1:50的比例，將2 mg/mL的Proteinase K溶液用PBS稀釋至終濃度40 µg/mL，在每個樣本上滴加100 µL，使溶液覆蓋全部樣本區(qū)域，37℃孵育20 min。 
注：Proteinase K 可通透細胞膜和核膜，從而使后續(xù)步驟的染色試劑充分進入細胞核進行反應(yīng)，提高標記效率。孵育時間過長會增加組織切片在后續(xù)洗滌步驟中從載波片上脫落的風險，過短則可能造成透性處理不充分，影響標記效率。為得到更好的結(jié)果，Proteinase K 的濃度、孵育時間、溫度需根據(jù)不同類型組織樣本進行優(yōu)化。如優(yōu)化Proteinase K的濃度與孵育時間仍無法改善染色效果，可選擇將樣本浸入1%Triton X-100（PBS 配制）中，室溫促滲 3-5 min；之后將切片樣本浸入 1×PBS 漂洗三次，每次 5 min。 
d. 將切片樣本浸入 1×PBS 漂洗三次，每次5 min，用濾紙吸去多余的液體，將處理好的樣本放在濕盒中保持濕潤。 

（5）陽性處理（僅陽性對照進行此步驟，其他樣品直接進行 TUNEL 反應(yīng)步驟）
a. 按1: 10的比例用ddH2O將10× DNase I Buffer 稀釋成1× DNase I Buffer 備用。
b. 滴加100 µL 1× DNase I Buffer 到已處理的樣本上，覆蓋全部樣本區(qū)域，室溫平衡5 min。
c. 用1× DNase I Buffer 以 1: 100 稀釋 DNase I (2 U/μL)至終濃度 20 U/mL的工作液。
d. 棄去Buffer，加入100 μL濃度為20 U/mL的 DNase I工作液，室溫孵育15 min。
e. 棄去DNase I 工作液，PBS清洗2次。
f. 轉(zhuǎn)步驟2. TUNEL 反應(yīng)。
2、TUNEL 反應(yīng)
（1）配制 TUNEL 反應(yīng)液（即用即配）：

（2）對于貼壁細胞、細胞涂片或組織切片
a.每個樣本加入 50 μL TUNEL 反應(yīng)液，使反應(yīng)液均勻覆蓋樣本。37℃避光孵育適宜的時間（細胞推薦染色時間 15-30min，組織染色時間推薦 1 h）。 
注：50 μL TUNEL 反應(yīng)液適合涂片、切片或 96 孔板（其他不同孔板可以適當調(diào)整 TUNEL 反應(yīng)液體積，覆蓋細胞即可）。如果待檢測的樣品為涂片、切片或在 24 孔板、12 孔板或 6 孔板中，可以使用防蒸發(fā)膜，或自行嘗試使用自封袋或者其它適當材料自行裁剪成比孔略小的圓形塑料片，滴加 TUNEL 反應(yīng)液后覆蓋在樣品上，可以防止TUNEL 反應(yīng)液蒸發(fā)，并且使TUNEL 反應(yīng)液均勻覆蓋樣本。 
b. 棄去 TUNEL 反應(yīng)液，PBS 清洗 2 次后，再用 0.1% Triton X-100（PBS 配制，其中含 5 mg/mL BSA）清洗 3 次，每次 5 min，這樣游離的未反應(yīng)的標記物可以清除較干凈。 
c.（可選）每個樣本加入適量濃度為 5 μg/mL 的 DAPI 染液，室溫避光孵育 5 min。染色完成后，棄去 DAPI 染液，PBS 清洗2 次，每次 5 min。 
d.（可選）切片封片：每個樣本滴加 20 μL 抗熒光淬滅封片劑（抗熒光淬滅封片劑可能會不適用于某些染料，實驗前建議進行預(yù)實驗測試匹配性），蓋上蓋玻片，用鑷子的鈍端輕輕敲擊蓋玻片，去除氣泡以使封片wan全。
e. 用濾紙吸去多余的液體，向樣本區(qū)域加 100 μL PBS 保持樣本濕潤，立即在熒光顯微鏡下觀察。

（3）對于懸浮細胞或細胞懸液
a.每個樣本管加入50 μL TUNEL反應(yīng)液輕輕重懸細胞，37℃避光孵育15-30min。每隔10 min用微量移液器輕輕重懸細胞。
b. 2000 rpm 離心 5 min，棄去 TUNEL 反應(yīng)液，用0.1% Triton X-100（PBS配制，其中含5 mg/mL BSA）清洗2次，每次 5 min，這樣游離的未反應(yīng)的標記物可以清除較干凈。 
c. 每個樣本管加入100 μL濃度為5 μg/mL的DAPI染液，室溫避光孵育5 min。
d. 加入400 μL PBS重懸細胞，立即用流式細胞儀檢測或進行涂片后在熒光顯微鏡下觀察。

-20℃保存，組分 A 需避光，避免反復凍融。