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Jackson ImmunoResearch艾美捷蛋白質(zhì)印跡指南

時(shí)間:2022/5/10閱讀:1309
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封閉對(duì)于防止轉(zhuǎn)移的蛋白質(zhì)、膜和實(shí)驗(yàn)中使用的后續(xù)試劑之間的非特異性相互作用至關(guān)重要。非特異性結(jié)合會(huì)產(chǎn)生背景信號(hào),從而干擾結(jié)果解釋。Jackson ImmunoResearch艾美捷教你如何選擇合適的封閉試劑。

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封閉試劑的選擇取決于蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)步驟中使用的二抗的種類。

 

蛋白封閉劑

封閉溶液的蛋白質(zhì)成分應(yīng)與被檢測(cè)的抗原和二抗的種類相容。

 

牛血清白蛋白 (BSA) 和脫脂奶粉通常用于封閉溶液,因?yàn)樗鼈兗缺阋擞秩菀撰@得。然而,它們并不總是合適的,并且可能是背景的原因。

 

當(dāng)使用針對(duì)來自?;蛳嚓P(guān)物種(如羊駝、山羊、馬或綿羊)的抗體的抗體時(shí),應(yīng)避免使用 BSA 和脫脂奶粉。在許多 BSA 制劑中發(fā)現(xiàn)低水平的牛免疫球蛋白 G (IgG)。

 

建議使用來自標(biāo)記二抗宿主物種的正常血清作為較佳封閉劑,以避免任何不必要的相互作用。使用前應(yīng)制備新鮮的血清工作溶液,通常在浸入膜之前在所選緩沖液中稀釋至 5% w/v。

 

緩沖溶液

通常使用 pH 范圍高于大多數(shù)抗體(pH 范圍 7.5-8.5)的等電點(diǎn) (pI) 的緩沖溶液,例如 Tris 緩沖鹽水 (TBS) 或磷酸鹽緩沖鹽水 (PBS)。如果磷酸化蛋白是印跡的焦點(diǎn),則不推薦使用 PBS

 

這是因?yàn)橐豢箍梢耘c緩沖液中的磷酸鹽以及靶蛋白結(jié)合。還應(yīng)考慮緩沖液 pH 值對(duì)檢測(cè)步驟中使用的報(bào)告酶(例如堿性磷酸酶)活性的影響。

 

非離子洗滌劑

非離子去污劑通常包含在蛋白質(zhì)印跡中使用的緩沖液中。它們可以防止聚集,這本身會(huì)導(dǎo)致背景,但也可以綁定到可能導(dǎo)致非特定交互的任何站點(diǎn)。

 

Tween-20™(通常為 0.1%)通常用作緩沖添加劑。

 

Jackson ImmunoResearch艾美捷 關(guān)于孵化時(shí)間和洗滌問題:

 

應(yīng)確定實(shí)現(xiàn)較佳信噪比所需的最短可能阻塞持續(xù)時(shí)間。雖然在 4°下過夜封閉可能很有吸引力,但過度封閉孵育會(huì)導(dǎo)致聚集和細(xì)菌生長(zhǎng),這可能會(huì)導(dǎo)致背景或干擾可視化。

 

封閉過程可能需要通過改變組分及其濃度、時(shí)間和溫度來進(jìn)行優(yōu)化,以獲得比較低的背景和比較高的信噪比。

 

值得注意的是,在封閉后用不含其蛋白質(zhì)成分的緩沖液清洗膜很重要,因?yàn)樗梢愿纳埔豢箤?duì)抗原表位的訪問。

 

注意:專有的阻塞解決方案

有幾種預(yù)配制的封閉溶液可供使用,它們?cè)谑袌?chǎng)上銷售時(shí)適用于所有實(shí)驗(yàn)條件。情況可能并非總是如此,盡管它們可能足以滿足一組條件。重要的是要考慮后續(xù)試劑的種類可能會(huì)排除使用通用封閉溶液,并且使用標(biāo)記抗體種類的正常血清可能更可靠。

 

注意:用 BSA 或牛奶封閉

牛血清白蛋白 (BSA) 和奶粉可能含有牛 IgG。抗羊駝、抗牛、抗山羊、抗馬和抗羊抗體會(huì)與牛 IgG 發(fā)生反應(yīng)。使用 BSA 或奶粉進(jìn)行封閉或稀釋可能會(huì)顯著增加背景和/或降低抗體滴度,應(yīng)避免使用具有這些特異性的抗體;使用標(biāo)記二抗宿主物種的正常血清 (5% v/v)。如果 BSA 被視為封閉劑,請(qǐng)使用不含 IgG 的試劑以降低背景電位。

 

 

Jackson ImmunoResearch專業(yè)從事生產(chǎn)和銷售親和純化的二抗和純化免疫球蛋白,僅用于研究,不用于診斷或治療用途。艾美捷科技是Jackson ImmunoResearch的中國(guó)代理商,為科研工作者提供優(yōu)質(zhì)的產(chǎn)品與服務(wù)。


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