快速T4 DNA連接酶質(zhì)量控制&使用說(shuō)明

快速T4 DNA連接酶由攜帶T4噬菌體基因30的大腸桿菌產(chǎn)生。這種酶催化雙鏈DNA或RNA的5'-磷酸基團(tuán)和3'-羥基之間形成磷酸二酯鍵。它可以修復(fù)雙鏈DNA、RNA或DNA/RNA雜交體中的單鏈缺口，并可以用粘性或鈍端連接DNA片段。然而，它對(duì)單鏈核酸沒(méi)有活性。主要用于酶切DNA片段的克隆、定點(diǎn)誘變、PCR產(chǎn)物的克隆和雙鏈DNA缺口的修復(fù)。快速T4 DNA連接酶需要ATP作為輔助因子，在室溫下僅需10分鐘即可完成粘性末端連接反應(yīng)

艾美捷快速T4 DNA連接酶：

Cat #: C-BSM205

Size: 1000 U

Storage: -20°C

酶活性定義：

在37°C下，1個(gè)Weiss單位的酶在20分鐘內(nèi)催化1 nmol[32PPi]轉(zhuǎn)化為吸附的活性碳。1 Weiss單元相當(dāng)于大約200個(gè)內(nèi)聚末端連接單元（CEU），這類(lèi)似于在16°C下30分鐘內(nèi)連接50%HindIII消化的λDNA片段。

質(zhì)量控制

殘余核酸內(nèi)切酶活性檢測(cè)：

在37℃下，將200U的Fast T4 DNA連接酶與1μg的pUC19 DNA孵育4小時(shí)。未檢測(cè)到從共價(jià)環(huán)狀DNA到刻痕DNA的轉(zhuǎn)化。

殘留核酸外切酶活性檢測(cè)：

將酶溶液與雙鏈DNA底物在37℃下孵育16小時(shí)。在

用DNA凝膠電泳法檢測(cè)雙鏈DNA底物。

藍(lán)色/白色屏幕：

在室溫下，將pUC57 DNA/HindII、pUC57 DNA/Pstl或pUC57脫氧核糖核酸/Smal消化產(chǎn)物與30U快速T4脫氧核糖核酸連接酶孵育1小時(shí)。然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為有能力的大腸桿菌XL1Blue細(xì)胞。Lessthan1%的白色菌落被檢測(cè)到。

快速T4 DNA連接酶使用說(shuō)明：

1.DNA插入片段與載體DNA的連接（粘性末端連接）：

① 在冰上制備以下反應(yīng)混合物：

② 充分混合并短暫離心，然后在22°C下孵育10分鐘。

③ 取1-5μl連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化50μl化學(xué)活性細(xì)胞，或取1-2μl轉(zhuǎn)化50μl電活性細(xì)胞。

注：如果連接產(chǎn)物用于電穿孔，則使用柱純化或氯仿提取來(lái)清潔DNA，而不是熱滅活步驟。

2.DNA插入片段與載體DNA的連接（鈍端連接）

3.線性DNA自環(huán)化

4.適配器結(jié)扎

雙鏈寡核苷酸適配器通常用于在插入片段上產(chǎn)生粘性末端。它們通常含有限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)，在連接和酶消化后，這些位點(diǎn)與克隆載體產(chǎn)生相容的末端。有時(shí)適配器已經(jīng)包含與克隆載體兼容的粘性末端，從而消除了在適配器連接后對(duì)插入片段進(jìn)行進(jìn)一步處理的需要

備注：

快速T4 DNA連接酶被高于200mM的NaCl或KCl濃度強(qiáng)烈抑制。

連接反應(yīng)混合物的量不應(yīng)超過(guò)感受態(tài)細(xì)胞體積的10%，系統(tǒng)中不建議使用過(guò)量的Fast T4 DNA連接酶。

與快速T4 DNA連接酶結(jié)合的DNA可能在瓊脂糖凝膠上表現(xiàn)出帶轉(zhuǎn)移或涂抹。為了避免這種情況

在這種現(xiàn)象下，可以在裝載前對(duì)酶進(jìn)行熱滅活，如有必要，可以加入適量的SDS。

聚乙二醇（PEG）顯著提高了鈍端結(jié)扎的效率。PEG 8000的推薦濃度為連接混合物的5%（w/v）。

電穿孔效率可以通過(guò)快速T4 DNA連接酶的熱失活或通過(guò)使用柱純化或氯仿提取進(jìn)行DNA純化來(lái)提高。轉(zhuǎn)化體的數(shù)量可以通過(guò)將反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)到1小時(shí)來(lái)增加。

該試劑僅用于科學(xué)研究領(lǐng)域，不適用于臨床診斷或其他用途。