昆蟲(chóng)細(xì)胞無(wú)血清懸浮生長(zhǎng)培養(yǎng)基使用方法詳細(xì)說(shuō)明

昆蟲(chóng)細(xì)胞無(wú)血清懸浮生長(zhǎng)培養(yǎng)基--這種產(chǎn)品是無(wú)血清的、完-全懸浮的細(xì)胞培養(yǎng)基，適用于各種細(xì)胞系，支持高密度細(xì)胞生長(zhǎng)。它具有兩倍的時(shí)間、高活力和與廣泛的細(xì)胞類型兼容的特點(diǎn)。當(dāng)與Bac到Bac昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)結(jié)合使用時(shí)，它可以在HiFive和SF9昆蟲(chóng)細(xì)胞中高效和穩(wěn)定地表達(dá)多種蛋白質(zhì)。與Bac和SF9細(xì)菌桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)結(jié)合，可以有效和穩(wěn)定地在HiFivea和SF9害蟲(chóng)細(xì)胞中表達(dá)多種蛋白質(zhì)。

艾美捷昆蟲(chóng)細(xì)胞無(wú)血清懸浮生長(zhǎng)培養(yǎng)基基本參數(shù)：

貨號(hào)：A-EXO005

規(guī)格：500mL, 1000mL

保存條件: 4℃避光保存；保質(zhì)期 12 個(gè)月。

昆蟲(chóng)細(xì)胞無(wú)血清懸浮生長(zhǎng)培養(yǎng)基使用方法：

昆蟲(chóng)懸浮細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境

細(xì)胞培養(yǎng)條件：溫度曲線：27℃±0.5℃、濕度曲線：70%±20%、無(wú)需 CO2、120rpm（振幅：25）。培養(yǎng)過(guò)

程中需注意以下三點(diǎn)：

1） 保證搖床 24 小時(shí)正常運(yùn)轉(zhuǎn)；

2） 防止外界環(huán)境溫度過(guò)高，導(dǎo)致培養(yǎng)箱內(nèi)溫度失控；

3） 防止培養(yǎng)箱內(nèi)水盤(pán)缺水，導(dǎo)致培養(yǎng)箱內(nèi)濕度過(guò)低。

培養(yǎng)基適應(yīng)

1. 直接適應(yīng)：最初培養(yǎng)階段，Hi Five 細(xì)胞按初始密度 0.5×10

6 cells/mL 接種，SF9 細(xì)胞按初始密度 1.0×10

6

cells/mL 接種，直接將培養(yǎng)基更換為昆蟲(chóng)細(xì)胞無(wú)血清懸浮生長(zhǎng)培養(yǎng)基 (A-EXO005) 進(jìn)行培養(yǎng)。待細(xì)胞培養(yǎng) 2-3

代，且生長(zhǎng)穩(wěn)定后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。Hi Five 細(xì)胞穩(wěn)定生長(zhǎng)時(shí)按 0.5×10⁶cells/mL 密度接種，SF9 細(xì)胞穩(wěn)定生長(zhǎng)時(shí)按 1.0×10⁶cells/mL 密度接種，培養(yǎng) 72h 后均可達(dá)到 5-7×10⁶ cells/mL，細(xì)胞活率≥90%。

2. 間接適應(yīng)：A-EXO005 培養(yǎng)基與細(xì)胞原培養(yǎng)基 1：1 混合培養(yǎng)細(xì)胞，連續(xù)傳 2-3 代，細(xì)胞穩(wěn)定生長(zhǎng)后可將培

養(yǎng)基更換為 A-EXO005 培養(yǎng)基，再傳 2-3 代，細(xì)胞生長(zhǎng)穩(wěn)定后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。Hi Five 細(xì)胞穩(wěn)定生長(zhǎng)時(shí)按 0.5×10⁶ cells/mL 密度接種，SF9 細(xì)胞穩(wěn)定生長(zhǎng)時(shí)按 1.0×10⁶cells/mL 密度接種，培養(yǎng) 72h 后均可達(dá)到 5-7×10⁶cells/mL，細(xì)胞活率≥90%。

3. 注意事項(xiàng)：

3.1. 根據(jù)細(xì)胞具體情況選擇進(jìn)行培養(yǎng)基直接適應(yīng)或者間接適應(yīng)。

3.2 細(xì)胞馴化初期，若出現(xiàn)密度低、結(jié)團(tuán)等不穩(wěn)定狀態(tài)，根據(jù)密度選擇合適的傳代方式。

a. 稀釋傳代：根據(jù)細(xì)胞密度計(jì)算傳代時(shí)所需細(xì)胞懸液，去除多余細(xì)胞懸液并補(bǔ)加新鮮培養(yǎng)基。

b. 離心傳代：根據(jù)細(xì)胞密度計(jì)算傳代時(shí)所需細(xì)胞懸液，800rpm（114g）離心 5min，去除上清，用新鮮

培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。

4. 細(xì)胞正常狀態(tài)傳代：

昆蟲(chóng)懸浮細(xì)胞復(fù)蘇：

1. 預(yù)熱培養(yǎng)基：取 20mL 的對(duì)應(yīng)培養(yǎng)基置于 27℃預(yù)熱，保證預(yù)熱充分。

2. 將凍存管從液氮罐或-80℃冰箱中取出，迅速轉(zhuǎn)移至 37℃水浴中，快速搖晃，直至完-全融化。

3. 取預(yù)熱好的培養(yǎng)基 5mL 于無(wú)菌離心管中，并將解凍后的細(xì)胞懸液移入此離心管中。800rpm 離心 5min（除去凍存液中 DMSO）。

4. 離心后棄去上清，用 15mL 預(yù)熱好的培養(yǎng)基（保證較高細(xì)胞密度）重懸細(xì)胞，移至相應(yīng)搖瓶，放于培養(yǎng)箱中

懸浮培養(yǎng)。

昆蟲(chóng)懸浮細(xì)胞傳代：

1. Hi Five 細(xì)胞復(fù)蘇初期傳代：

細(xì)胞復(fù)蘇后前兩代，如果細(xì)胞密度＞2×10⁶ cells/mL，取部分細(xì)胞懸液離心傳代，按初始密度 0.8×10⁶ cells/mL

接種；如果細(xì)胞密度≤2×10⁶ cells/mL，進(jìn)行全部離心換液（細(xì)胞剛復(fù)蘇會(huì)有細(xì)胞碎片，屬正?，F(xiàn)象）。

2. SF9 細(xì)胞復(fù)蘇初期傳代：

復(fù)蘇后 2-3 天取樣計(jì)數(shù)，若細(xì)胞密度＜2×10⁶cells/mL 以下，細(xì)胞不做任何處理，繼續(xù)培養(yǎng) 2-3 天（復(fù)蘇后 4-6天），取樣計(jì)數(shù)，若細(xì)胞密度 2-5×10⁶cells/mL，直接向搖瓶中加入新鮮培養(yǎng)基將細(xì)胞密度調(diào)整至 1×10⁶cells/mL左右，切忌不要離心傳代，繼續(xù)培養(yǎng)，若細(xì)胞密度＞5×10⁶cells/mL，可正常稀釋傳代。

3. Hi Five 活細(xì)胞初期傳代：

收到細(xì)胞后，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至搖瓶中，取樣計(jì)數(shù)并查看細(xì)胞狀態(tài)，如果細(xì)胞密度＞2×10⁶ cells/mL，可以稀釋傳代，按 0.8×10⁶ cells/mL 接種；如果細(xì)胞密度≤2×10⁶ cells/mL，建議全部離心傳代。（細(xì)胞經(jīng)歷運(yùn)輸過(guò)程會(huì)有細(xì)胞碎片，屬正常現(xiàn)象）。

4. SF9 活細(xì)胞初期傳代：

收到細(xì)胞后，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至搖瓶中，取樣計(jì)數(shù)并查看細(xì)胞狀態(tài)，如果細(xì)胞密度≥5×10⁶ cells/mL，可以稀釋傳代，按 2×10⁶ cells/mL 接種；如果細(xì)胞密度＜5×10⁶ cells/mL，繼續(xù)培養(yǎng) 1-4 天，此期間需每 24h 取樣計(jì)數(shù)查看細(xì)胞狀態(tài)，當(dāng)細(xì)胞密度≥5×10⁶ cells/mL，按 2×10⁶ cells/mL 接種，稀釋傳代，直至細(xì)胞恢復(fù)正常狀態(tài)后，按1×10⁶ cells/mL 接種。（細(xì)胞經(jīng)歷運(yùn)輸過(guò)程會(huì)有細(xì)胞碎片，屬正常現(xiàn)象）。

昆蟲(chóng)懸浮細(xì)胞凍存：

1. 待細(xì)胞恢復(fù)至正常狀態(tài)后，擴(kuò)大細(xì)胞培養(yǎng)體積準(zhǔn)備凍存建庫(kù)。盡量多建細(xì)胞庫(kù)，保證備份充足。

2. 含血清凍存：選擇處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、活率＞90%細(xì)胞進(jìn)行凍存，凍存細(xì)胞密度：15-20×10⁶ cells/mL，推薦20×10⁶ cells/mL。

無(wú)血清凍存：選擇處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、活率＞90%細(xì)胞進(jìn)行凍存，凍存細(xì)胞密度：30-40×10⁶ cells/mL，推薦40×10⁶ cells/mL。

3. 準(zhǔn)備凍存盒：向程序降溫盒注入適量異丙醇，置于 4℃冰箱預(yù)冷。

4. 含血清細(xì)胞凍存液配制：凍存液=40%新鮮培養(yǎng)基+50%FBS（建議使用進(jìn)口胎牛血清）+10%DMSO，凍存液配好后置于 4℃冰箱預(yù)冷。

無(wú)血清細(xì)胞凍存液配制：凍存液=45%新鮮培養(yǎng)基+45%細(xì)胞培養(yǎng)上清+10%DMSO，凍存液配好后置于 4℃冰箱預(yù)冷。

凍存液配制時(shí)，先加培養(yǎng)基再加血清或 DMSO，防止 DMSO 濃度過(guò)高導(dǎo)致血清有效成分變性。

5. 取細(xì)胞懸液，800rpm 離心 5min，棄去上清，用適量細(xì)胞凍存液重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至目標(biāo)值。

6. 快速分裝細(xì)胞液至凍存管中。

7. 將凍存管放入程序降溫盒中，放于-80℃冰箱，24h 后轉(zhuǎn)至液氮罐中儲(chǔ)存。一段時(shí)間后復(fù)蘇檢測(cè)。

該試劑僅用于科學(xué)研究領(lǐng)域，不適用于臨床診斷或其他用途。