ALPCO超敏感胰島素ELISA是一種夾心型免疫分析法。96孔微孔板涂有針對(duì)胰島素的單克隆抗體。標(biāo)準(zhǔn)品、樣本和對(duì)照品與檢測(cè)抗體一起加入微孔板孔中。然后，微孔板在室溫下以700-900轉(zhuǎn)每分鐘的速度在微孔板振蕩器上孵育。第一次孵育完成后，用洗滌緩沖液清洗孔并吸干。加入TMB底物，微孔板在室溫下第二次在微孔板振蕩器上以700-900轉(zhuǎn)每分鐘的速度孵育。第二次孵育完成后，加入停止溶液，并通過(guò)分光光度計(jì)在450 nm處測(cè)量光密度（OD）。產(chǎn)生的色度強(qiáng)度與樣本中胰島素的含量成正比。

供應(yīng)的材料：

Component Quantity Preparation

Insulin Microplate (96 wells) 12x8 strips Ready to use

Zero Standard (0 μlU/mL) 5 mL Ready to use

"Standards (A-E)

(0.15,1,3,10,20 μlU/mL)" 1 mL each Ready to use

Diabetes Control Level 1* 1 vial each Lyophilized*

Detection Antibody 12 mL Ready to use

Wash Buffer Concentrate 40 mL 21X

TMB Substrate 12 mL Ready to use

Stop Solution 12 mL Ready to use

Plate Sealers 3 Ready to use

**請(qǐng)參閱每個(gè)試劑盒隨附的分析證書(shū)，了解批次特定的控制范圍和復(fù)溶量。

超敏胰島素ELISA測(cè)定程序：

使用前應(yīng)將所有試劑和微孔板條平衡至室溫（18-25°C）。使用前輕輕混合所有試劑。每次測(cè)定運(yùn)行和每次使用多個(gè)微孔板時(shí)，都必須進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定。所有標(biāo)準(zhǔn)品、樣本和對(duì)照品都應(yīng)雙重測(cè)定。

1. 在打開(kāi)鋁箔袋之前，應(yīng)將微孔板平衡至室溫。為標(biāo)準(zhǔn)品、對(duì)照品和樣本的雙重測(cè)定準(zhǔn)備足夠的微孔板條。剩余的微孔板條應(yīng)存放在含有干燥劑的緊閉鋁箔袋中，儲(chǔ)存在2-8°C。

2. 分別向各自孔中移液25 µL的標(biāo)準(zhǔn)品、對(duì)照品和樣本。參見(jiàn)試劑準(zhǔn)備和分析證明書(shū)中的對(duì)照品重組說(shuō)明。

3. 向每個(gè)孔中移液100 µL的檢測(cè)抗體。

4. 用板封膜覆蓋微孔板，在室溫下振蕩孵育1小時(shí)，振蕩速度為700-900 rpm。

5. 倒掉孔中的內(nèi)容物，并使用微孔板洗滌器每次用350 µL的工作強(qiáng)度洗滌緩沖液洗滌微孔板6次（參見(jiàn)試劑準(zhǔn)備）。或者，使用配備洗滌噴嘴的洗滌瓶將工作強(qiáng)度洗滌緩沖液注入孔中。（不建議使用多通道移液器。必須用足夠且相等的力量分配洗滌緩沖液，以便正確洗滌孔。）在洗滌之間，將微孔板倒置以丟棄液體，并在吸水紙上用力拍打倒置的微孔板。在最后一次洗滌后（自動(dòng)或手動(dòng)），通過(guò)倒置并在吸水紙上用力拍打微孔板，從孔中去除任何殘留的洗滌緩沖液和氣泡。

6. 向每個(gè)孔中移液100 µL的TMB底物。

7. 用板封膜覆蓋微孔板，在室溫下振蕩孵育30分鐘，振蕩速度為700-900 rpm。

8. 向每個(gè)孔中移液100 µL的停止溶液，并輕輕搖晃微孔板以混合內(nèi)容物。在進(jìn)行下一步之前去除任何氣泡。

9. 將微孔板放入能夠讀取450nm吸光度的微孔板讀取器中。在加入停止溶液后應(yīng)立即分析微孔板，且不得超過(guò)30分鐘。

超敏胰島素ELISA結(jié)果計(jì)算：

從標(biāo)準(zhǔn)品構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。零標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)作為空白，其平均值應(yīng)從每個(gè)孔中減去。建議使用軟件程序計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線并確定樣本的濃度。ALPCO超敏感胰島素ELISA是一種配體結(jié)合測(cè)定法，其響應(yīng)與分析物濃度呈S形關(guān)系。目前接受的此類曲線的參考模型使用4或5參數(shù)邏輯（pl）擬合，因?yàn)檫@些模型在更大范圍內(nèi)優(yōu)化了準(zhǔn)確性和精確性。盡管三次樣條和其他模型是可接受的方法，但它們通常在DIGAO端的范圍內(nèi)顯示出較低的測(cè)定內(nèi)準(zhǔn)確性和精確性。

在以下示例中，使用了5-pl曲線擬合，以大化低濃度樣本的準(zhǔn)確性和精確性。然而，由于個(gè)別實(shí)驗(yàn)室條件的影響，所有模型在可檢測(cè)范圍的DI和GAO端的準(zhǔn)確性和精確性都是有限的。因此，在解釋分析物響應(yīng)變得非線性的結(jié)果時(shí)，應(yīng)始終謹(jǐn)慎。

典標(biāo)準(zhǔn)曲線：

以下結(jié)果僅用于演示目的，不能代替通過(guò)測(cè)定獲得的數(shù)據(jù)。