BioAuxilium/THUNDER磷酸-4EBP1(T37/T46)TR-FRET細(xì)胞信號(hào)檢測試劑盒方案

夾心法TR-FRET免疫檢測法，用于細(xì)胞裂解液中磷酸化4EBP1（T37/T46）的半定量檢測。完整的檢測驗(yàn)證信息可在技術(shù)資料表中查閱。詳細(xì)的檢測操作步驟描述于通用用戶手冊(cè)中。檢測性能的對(duì)比分析展示在更新后的應(yīng)用說明書中。

艾美捷BioAuxilium-THUNDER磷酸-4EBP1(T37/T46)TR-FRET細(xì)胞信號(hào)檢測試劑盒組分：

Eu-磷酸化4EBP1抗體（25 µL）

Acc-磷酸化4EBP1抗體（100 µL）

4EBP1對(duì)照裂解液（200 µL）

5倍濃縮裂解緩沖液2（5 mL）

10倍濃縮TR-FRET檢測緩沖液（250 µL）

100倍濃縮磷酸酶抑制劑混合液（250 µL）

BioAuxilium-THUNDER磷酸-4EBP1(T37/T46)TR-FRET細(xì)胞信號(hào)檢測試劑盒(#KIT-4EBP1P-500)配套試劑：

THUNDER™ 4EBP1對(duì)照裂解液

THUNDER™裂解緩沖液2（5倍濃縮）

THUNDER™ TR-FRET檢測緩沖液（10倍濃縮）

THUNDER™磷酸酶抑制劑混合液（100倍濃縮）

THUNDER磷酸-4EBP1(T37/T46)TR-FRET細(xì)胞信號(hào)檢測試劑盒檢測原理：

磷酸化4EBP1（T37/T46）檢測試劑盒是一種均相時(shí)間分辨熒光共振能量轉(zhuǎn)移（TR-FRET）夾心免疫檢測法（見圖1）。THUNDER™細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)檢測工作流程包含3個(gè)步驟（見圖2）。在細(xì)胞處理后，首先使用試劑盒中提供的特定裂解緩沖液將細(xì)胞裂解。然后，通過一對(duì)熒光標(biāo)記的抗體以簡單的“加入-孵育-測量"格式（單步試劑添加；無需洗滌步驟）檢測細(xì)胞裂解液中的磷酸化4EBP1（T37/T46）。其中一個(gè)抗體標(biāo)記有供體熒光團(tuán)（銪螯合物；Eu-Ab1），另一個(gè)抗體標(biāo)記有遠(yuǎn)紅接受體熒光團(tuán)（FRAb2）。兩種標(biāo)記抗體結(jié)合到目標(biāo)蛋白上不同的表位，使兩種染料靠近。使用閃光燈（320或340 nm）或激光（337 nm）激發(fā)供體銪螯合物分子時(shí)，會(huì)觸發(fā)從供體到接受體分子的FRET，接受體分子隨后在665 nm處發(fā)射TR-FRET信號(hào)。銪螯合物的剩余能量在615 nm處產(chǎn)生光。665 nm處的信號(hào)與細(xì)胞裂解液中磷酸化4EBP1（T37/T46）的濃度成正比。數(shù)據(jù)可以表示為665 nm處的信號(hào)，或665 nm/615 nm的比值。

圖1：TR-FRET細(xì)胞信號(hào)測定原理的示意圖。

圖2：使用2板（轉(zhuǎn)移）協(xié)議的檢測工作流程。

試劑盒性能對(duì)比——與其他TR-FRET技術(shù)的比較

作為檢測驗(yàn)證的一部分，THUNDER™磷酸化4EBP1（T37/T46）檢測試劑盒與一種競爭性TR-FRET檢測技術(shù)（公司A）進(jìn)行了性能對(duì)比。具體而言，兩種不同的檢測方法在檢測A431細(xì)胞經(jīng)PP242處理后基礎(chǔ)磷酸化4EBP1（T37/T46）抑制的能力上進(jìn)行了并排比較，實(shí)驗(yàn)采用雙板檢測協(xié)議。所有試劑均按照各自制造商的推薦進(jìn)行準(zhǔn)備。細(xì)胞處理后，使用相應(yīng)試劑盒的1X補(bǔ)充裂解緩沖液將細(xì)胞裂解。隨后，裂解液在同一塊384孔檢測板上按照相應(yīng)試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)協(xié)議進(jìn)行測試。在孵育4小時(shí)后，使用EnVision®（閃光燈激發(fā)）讀取結(jié)果。數(shù)據(jù)顯示，兩種TR-FRET檢測方法表現(xiàn)出相當(dāng)?shù)撵`敏度（IC50值）和信背比（S/B）。

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