髓過氧化物酶活性測定試劑盒--測量每孔低于0.05mU的酶活性

髓過氧化物酶（Myeloperoxidase），一種氧化酶，在中性粒細(xì)胞中大量表達(dá)。當(dāng)中性粒細(xì)胞被激活時，髓過氧化物酶（MPO）被釋放到細(xì)胞外空間，在那里它催化從過氧化氫和氯離子形成次氯酸（HOCl）。次氯酸是一種非常強(qiáng)的氧化劑，能夠殺死入侵的細(xì)菌、病毒和真菌。髓過氧化物酶的活性除了在宿主防御中的作用外，還具有代謝意義，因為它還可以氧化脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和DNA，導(dǎo)致在慢性炎癥狀況（如動脈粥樣硬化、慢性阻塞性肺病和神經(jīng)退行性疾病）中的氧化損傷。AkrivisBio的髓過氧化物酶檢測是一種簡單敏感的方法，用于測量每孔低于0.05mU的酶活性。

艾美捷髓過氧化物酶活性測定試劑盒：

貨號：MA-0135

孔數(shù)：100孔

樣本類型：細(xì)胞裂解物、組織提取物、尿液、血清、其他生物液體

物種：所有物種

檢測方法：比色法，OD 412納米

檢測類型：定量

應(yīng)用：一種基于板的比色法檢測，用于測量多種樣本類型中髓過氧化物酶（MPO）的酶活性。

靈敏度：<0.05 mU/孔

儲存條件：-20°C

運(yùn)輸溫度：使用冰袋

髓過氧化物酶活性測定試劑盒檢測組分：

-檢測緩沖液25毫升WMMA-0135-A

-DTNB50微升紅色MA-0135-B

-TCEP50微升透明MA-0135-C

-過氧化氫50微升藍(lán)色MA-0135-D

-停止試劑（過氧化氫酶）凍干綠色MA-0135-E

-髓過氧化物酶陽性對照凍干紫色MA-0135-F

髓過氧化物酶活性測定試劑盒檢測原理：

1.髓過氧化物酶從過氧化氫和氯離子產(chǎn)生次氯酸（HOCl）

2.次氯酸與牛磺酸反應(yīng)形成?；撬崧劝?/span>

3.牛磺酸氯胺與TNB反應(yīng)，TNB是DTNB的還原形式，Ellman試劑，使顏色褪去，導(dǎo)致吸光度下降。

儲存和處理：

使用前將試劑盒儲存在-20°C。使用前讓檢測緩沖液升溫至室溫。打開前短暫離心小瓶。

-檢測緩沖液：按提供使用。儲存在4°C。

-DTNB試劑：按提供使用。儲存在4°C

-TCEP：按提供使用。儲存在4°C

-過氧化氫：按提供使用。儲存在4°C。

-停止試劑（過氧化氫酶）：用200微升的DIH2O重懸。儲存在-20°C。

-髓過氧化物酶陽性對照：用100微升檢測緩沖液重懸。儲存在-20°C。

注意：如果檢測將在一段時間內(nèi)多次使用，請將酶（停止試劑和陽性對照）分裝成方便的份量，并儲存在-20°C以避免重復(fù)凍融循環(huán)。

檢測方案：

1.工作溶液：

TNB試劑：為標(biāo)準(zhǔn)孔制作TNB試劑。TNB很容易氧化為DTNB，因此需要時再準(zhǔn)備，即在要使用的當(dāng)天。取2微升DTNB，2微升TCEP和196微升檢測緩沖液，混合均勻并放在冰上。丟棄任何未使用的TNB試劑。

過氧化氫：為準(zhǔn)備工作溶液，將5微升過氧化氫轉(zhuǎn)移到300微升的DIH2O中。在立即使用前制作工作溶液。丟棄任何未使用的部分。

2.標(biāo)準(zhǔn)曲線：將0–10–20–30–40–50微升TNB試劑轉(zhuǎn)移到96孔板上的一系列孔中。通過分別向孔中添加150、140、130、120、110和100微升的檢測緩沖液，使所有孔的體積達(dá)到150微升，得到0–10–20–30–40–50納摩爾的TNB。

3.在412納米處讀取標(biāo)準(zhǔn)曲線值。

4.樣本準(zhǔn)備：

將組織（10毫克）或細(xì)胞（10^6）在100微升的檢測緩沖液中勻漿，以16,000Xg離心5分鐘，以去除顆粒/細(xì)胞碎片。將清澈的上清液轉(zhuǎn)移到新鮮試管中。將5-50微升轉(zhuǎn)移到96孔板中。用檢測緩沖液稀釋血清并轉(zhuǎn)移到孔中。對于中性粒細(xì)胞：取2毫升血液，使用10倍體積的紅細(xì)胞裂解緩沖液（150mM氯化銨，10mM碳酸氫鈉，0.1mMEDTA）裂解；在室溫下孵育10分鐘。以400xg離心5分鐘；小心移除上清液。用1毫升1XPBS洗滌沉淀物，并以400xg離心5分鐘，然后小心移除上清液。使用200微升檢測緩沖液裂解沉淀物；在冰上放置10分鐘。然后以16,000xg離心5分鐘以去除顆粒。將清澈的上清液轉(zhuǎn)移到新鮮試管中。將最多10微升的裂解液以雙份轉(zhuǎn)移到96孔板中，使用一個孔作為背景對照。用檢測緩沖液調(diào)整所有樣本和背景孔的體積至50微升。

5.陽性對照：將5微升重懸的髓過氧化物酶陽性對照轉(zhuǎn)移到可選的陽性對照孔中。用檢測緩沖液調(diào)整孔的體積至50微升。

6.啟動反應(yīng)：每個孔將需要50微升的反應(yīng)混合物。向每個樣本和陽性對照孔中添加50微升的反應(yīng)混合物。向背景對照孔中添加50微升的背景對照混合物。混合均勻。不要向標(biāo)準(zhǔn)孔中添加反應(yīng)混合物。

7.在25°C下孵育板30分鐘。然后向所有樣本、標(biāo)準(zhǔn)、背景對照和陽性對照孔中添加2微升停止試劑?；旌喜⒃?span style="font-family: Calibri;">10分鐘內(nèi)孵育板以停止反應(yīng)。理想情況下，樣本將在檢測結(jié)束時給出標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍的50-90%的信號。如果30分鐘后信號太低，請重復(fù)更長時間的檢測。如果信號大于標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍的90%，請用較少或稀釋的樣本重新運(yùn)行檢測。如果酶活性低，2或3小時的運(yùn)行時間是可以接受的。在此孵育階段，準(zhǔn)備TNB試劑并保持在冰上。準(zhǔn)備足夠的試劑以滿足包括樣本、背景對照和陽性對照在內(nèi)的總孔數(shù)。每個孔將需要50微升。向每個樣本、背景對照和陽性對照孔中添加50微升TNB試劑。

8.測量：添加TNB試劑后，等待5-10分鐘，讓TNB褪色，然后在412納米處讀取。陽性對照和樣本將顯示出與酶存在量成比例的顏色減少。這可以通過簡單地計算OD（412納米）背景-OD（412納米）樣本來計算。接近標(biāo)準(zhǔn)范圍g端的值是可疑的，那些樣本應(yīng)該稀釋并重新運(yùn)行。

9.典型結(jié)果：

10.計算：從所有標(biāo)準(zhǔn)讀數(shù)中減去0標(biāo)準(zhǔn)讀數(shù)。繪制TNB標(biāo)準(zhǔn)曲線。確定標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率。這定義了溶液中OD/納摩爾TNB。從配對樣本吸光度值中減去背景對照孔值。這個差異對應(yīng)于反應(yīng)過程中消耗的TNB。將這個背景校正的吸光度除以標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率，得到孔中消耗的納摩爾TNB。除以反應(yīng)時間得到納摩爾/分鐘（孔中的mU酶活性）。要轉(zhuǎn)換回原始樣本中的酶活性：

A.將孔中的mU除以添加到孔中的樣本微升數(shù)=mU/微升樣本

B.將mU/微升樣本乘以回收的上清液總體積=樣本中的總mU酶活性

C.將樣本中的總mU酶活性除以處理的原始樣本毫克數(shù)（或細(xì)胞數(shù)或血液毫升數(shù)等）