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技術(shù)文章

細胞共定位

閱讀:641          發(fā)布時間:2018-7-19

實驗試劑

高保真聚合酶(pfu ultra),限制性內(nèi)切酶(XhoI、SpeI、BamHI、SpeI、SacI),金粉,無水乙醇,2.5MCaCl2,20ul 0.1M亞精胺
實驗設(shè)備

PCR擴增儀,PDS-1000/He型基因槍,激光共聚焦顯微鏡(Carl Zeiss LSM 510 )
實驗材料

洋蔥
實驗步驟

1. 載體的構(gòu)建
pA7- CFP- AtCOP1,pA7-AtCRY1-YFP
pA7- CFP-OsCOPl,pA7-OsCRY1b-YFP
中間載體pA7-CFP和pA7-YFP為本實驗室構(gòu)建。將AtCOPl(引物為AtCOP1XhoI5' 和AtCOP1 SpeI3')和AtCRYl(引物為AtCRY1XhoI5'和AtCCT1SpeI3')分別用高保真聚合酶(pfu ultra)進行PCR擴增,純化PCR產(chǎn)物,用XhoI/SpeI雙酶切后,分別連接入pA7-CFP和pA7-YFP的多克隆位點上,得到pA7-AtCOP 1-CFP,pA7-AtCRYl-YFP。
將OsCRYlb用高保真聚合酶(pfu ultra)進行PCR擴增(引物為OsCRY 1 bBamHI5'和OsCCTlbSpeI3'),純化PCR產(chǎn)物,用BamHI/SpeI雙酶切后連接入pA7-YFP的多克隆位點中,得到pA7-OsCRYlb-YFP。
將嵌合的OsCOPl用高保真的聚合酶(pfu ultra)進行PCR擴增(引物為AtCOP1XhoI5'和 OsCOP1SacI3'),純化PCR產(chǎn)物,用XhoI/SacI雙酶切后連接入pA7-YFP的多克隆位點SalI/SacI中,得到pA7-OsCOPl-CFP。所有克隆經(jīng)DNA測序正確后使用。
2. 基因槍操作
   1) 微彈制備(金粉母液制備)
      a. 稱取60mg(或3mg)金粉加入Eppendorf管。
      b. 加入1mL(或50uL)無水乙醇,振蕩lmin,10,000rpm離心l0s。
      c. 棄上清,加入1mL(或50uL)無菌水,振蕩lmin,10,000rpm離心l0s。
      d. 棄上清,加入1mL(或50uL)無菌水,振蕩1 min,-20℃保存。
   2) DNA的包裹
      a. 取50uL金粉懸液于Eppendorf管。
      b. 依次加入5uL質(zhì)粒DNA (1ug/ul),50ul 2.5MCaCl2和20ul 0.1M亞精胺(每加完一樣,振蕩2-3秒)。
      c. 振蕩3min,10,000rpm離心10-20秒,棄上清。
      d. 加250ul無水乙醇,振蕩重懸,10,000rpm離心10-20秒,棄上清。
      e. 用60ul無水乙醇定容(需重懸)。
   3) 基因槍操作
      a. 基因槍轟擊的前一天將新鮮洋蔥的鱗葉切成小塊(3-5cm長寬),置于MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)過夜。
      b. 轟擊之前將洋蔥的內(nèi)表面朝上,用PDS-1000/He型基因槍將上述質(zhì)粒轟擊入洋蔥內(nèi)表皮,黑暗培養(yǎng)24h。
      c. 激光共聚焦顯微鏡觀測(Carl Zeiss LSM 510 )。

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