產(chǎn)品及特點(diǎn) 牛細(xì)小病毒(Bovine Parvovirus,BPV) 會(huì)引發(fā)牛細(xì)小病毒感染，是一種接觸性傳染病,以下痢為主要癥狀,其特征是母牛生殖機(jī)能障礙，導(dǎo)致妊娠母牛感染導(dǎo)致流產(chǎn)、死胎，犢牛感染則表現(xiàn)腸炎、腹瀉。牛細(xì)小病毒感染在牛群中發(fā)生比較廣泛，目前國(guó)內(nèi)外對(duì)其研究的較少,發(fā)生此病的國(guó)家也不多，本產(chǎn)品就是以染料法熒光定量PCR技術(shù)為基礎(chǔ)開(kāi)發(fā)的專門檢測(cè)牛細(xì)小病毒的試劑盒，它具有下列特點(diǎn)：

1.即開(kāi)即用，用戶只需要提供樣品DNA模板。

2.引物和探針經(jīng)過(guò)優(yōu)化，靈敏性高。

3.提供陽(yáng)性對(duì)照，便于區(qū)分假陰性樣品。

4.特異性高，引物是根據(jù)牛細(xì)小病毒高度保守區(qū)設(shè)計(jì)，不會(huì)跟其他病毒的DNA發(fā)生交叉反應(yīng)。

5.本產(chǎn)品足夠50次20μL體系的探針?lè)晒舛縋CR反應(yīng)。

6.本產(chǎn)品只能用于科研。

規(guī)格及成分 成分 編號(hào) 十孔盒包裝

2×Probe qPCR MagicMix 190303 0.5 mL（本色蓋）

熒光PCR模板稀釋液 180701 1 mL（黃蓋）

牛細(xì)小病毒 PCR引物 15-44000yw 100 μL（白蓋）

牛細(xì)小病毒 qPCR探針 15-44000pro 100 μL（棕色管）

牛細(xì)小病毒陽(yáng)性對(duì)照2.0

(1×10E8拷貝/μL) 15-44000pc 50 μL（紅蓋）

天凈沙核酸釋釋劑試用裝 61202 50次（2.5mL）

使用手冊(cè) 15-44000sc 1份

 

運(yùn)輸及保存 低溫運(yùn)輸，-20℃保存，保存期限為12個(gè)月。

自備試劑 樣品DNA。

使用方法 一、稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品（以10E2-10E7拷貝/μL這6個(gè)10倍稀釋度為例）。由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行，千萬(wàn)不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原，本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽(yáng)性對(duì)照，只提供無(wú)傳染性的DNA片段作為陽(yáng)性對(duì)照。

1.標(biāo)記6個(gè)離心管，分別為7，6，5，4，3，2。

2.用帶芯槍頭分別加入45 μL熒光PCR模板稀釋液，用帶芯槍頭，下同）。

3.在7號(hào)管中加入5 μL 1×10E8拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照(試劑盒提供)，充分震蕩1分鐘，得1×10E7拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。

4.換槍頭，在6號(hào)管中加入5 μL 1×10E7拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1×10E6拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。

5.換槍頭，在5號(hào)管中加入5 μL 1×10E6拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1×10E5拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。

6.重復(fù)上面的操作直到得到6個(gè)稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。

二、樣品DNA的制備

7.如果有N個(gè)樣品，設(shè)置N+2個(gè)提取，多出的一個(gè)是PC（樣品制備陽(yáng)性對(duì)照），一個(gè)是NC（樣品制備陰性對(duì)照）?？梢杂?0μL陽(yáng)性對(duì)照的10000倍稀釋液再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣，以此作為PC。另外用水作為NC。

8.用自選方法純化樣品的DNA，本試劑盒跟市場(chǎng)上大多數(shù)病毒DNA提取試劑盒兼容。也可以選購(gòu)本公司的柱式病毒DNAout。本試劑盒免費(fèi)贈(zèng)送50次免DNA提取的天凈沙核酸釋放劑試用裝，該釋放劑的裂解液可以直接作為PCR模板，省略了DNA提取步驟。

三、Probe qPCR反應(yīng)（20μL體系，在樣品制備室進(jìn)行）

9.如果只做1次重復(fù)，則標(biāo)記N+9個(gè)PCR管，其中N+2個(gè)用于上步得到的N+2個(gè)樣品，1個(gè)用于PCR陰性對(duì)照，6個(gè)用于標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。

10.在標(biāo)記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復(fù)。樣品管和陰性對(duì)照設(shè)置完畢后才設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照，并且陽(yáng)性對(duì)照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲(chǔ)存好后后加）：

成分 樣品管

N+2個(gè) PCR陰性對(duì)照管 標(biāo)準(zhǔn)曲線

樣品管（2-7管）

2×Probe qPCR MagicMix 10 μL 10 μL 各10 μL

牛細(xì)小病毒 qPCR探針 2 μL 2 μL 各2 μL

牛細(xì)小病毒 PCR引物混合液 2 μL 2 μL 各2 μL

 待測(cè)樣品DNA模板 6 μL 不加 不加

第7步所得標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品稀釋液（2-7號(hào)） 不加 不加 各6μL（2號(hào)樣到2號(hào)管，3號(hào)樣到3號(hào)管…）

11.蓋上蓋子后上機(jī)，按下面參數(shù)進(jìn)行PCR：

過(guò)程 溫度 時(shí)間

預(yù)變性 94℃ 5 min

PCR反應(yīng)

（40個(gè)循環(huán)） 94℃ 0.5 min

55℃ 0.5 min（采集FAM通道的熒光信號(hào)）

72℃ 0.5 min

后延伸 72℃ 10min

12.如果把本試劑盒用于定量檢測(cè)，則以陽(yáng)性對(duì)照濃度的log值為橫軸，以Ct值為縱軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。再以待測(cè)樣品的Ct值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品DNA濃度的log值，再推算出其濃度。

13.如果把本試劑盒用于定性檢測(cè)，只判斷陽(yáng)性或陰性，則陰性對(duì)照Ct必須大于或等于40。陽(yáng)性對(duì)照必須有熒光對(duì)數(shù)增長(zhǎng)，有典型擴(kuò)增曲線，Ct值應(yīng)該小于或等于30。對(duì)待測(cè)樣品，如果其Ct大于或等于40則為陰性，如果小于或等于35則為陽(yáng)性。如果在35-40之間，則重復(fù)一次。重復(fù)實(shí)驗(yàn)的Ct值如果大于或等于40則為陰性，如果小于40，則為陽(yáng)性。

關(guān)聯(lián)產(chǎn)品 牛細(xì)小病毒可視化LAMP檢測(cè)試劑盒