1. 細(xì)胞污染的種類

 

細(xì)胞污染一般可分為微生物污染和真核生物污染。其中微生物污染包括真菌和酵母、細(xì)菌、支原體等。而真核生物一般是細(xì)胞系間的交叉污染。

 

細(xì)菌、真菌或酵母的污染很容易辨識(shí)，直接可通過培養(yǎng)基顏色變化、顯微鏡下觀察便可判斷。如細(xì)菌污染后細(xì)胞培養(yǎng)基變黃色，而且鏡下有小黑點(diǎn)，且有規(guī)律的運(yùn)動(dòng)。而酵母污染后培養(yǎng)基變紫色，鏡下可見透明、且連成一串的圓形。但如果是支原體污染的話，由于開始支原體生長(zhǎng)緩慢，而且顯微鏡下難以看出，因此很難發(fā)現(xiàn)。

真核細(xì)胞污染是指一種細(xì)胞污染了另外一種細(xì)胞，主要發(fā)生在操作不當(dāng)，尤其是長(zhǎng)時(shí)間進(jìn)行某些細(xì)胞系的研究而傳代時(shí)。目前越來越多的科研人員發(fā)現(xiàn)了細(xì)胞間污染這一被忽略的問題。據(jù)不*統(tǒng)計(jì)，約有 15-20% 的細(xì)胞存在細(xì)胞間污染。

2. 細(xì)胞污染對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響

不管發(fā)生哪種類型的污染都會(huì)造成相同的結(jié)果。即必須重新做實(shí)驗(yàn)，因此浪費(fèi)工作時(shí)間，增加實(shí)驗(yàn)成本，降低實(shí)驗(yàn)重復(fù)性。而且以污染細(xì)胞和未污染細(xì)胞為基礎(chǔ)進(jìn)行試驗(yàn)時(shí)，有可能得到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果*不同。更為嚴(yán)重的是，如果你所研究的細(xì)胞是另外一種細(xì)胞的話，那所做的所有工作可能會(huì)一文不值。

 

目前，學(xué)術(shù)界對(duì)細(xì)胞污染的報(bào)道越來越多。《The Scientist》期刊的 2008 年 9 月 16 日期發(fā)表了 Megan Scudellari 撰寫的題為 A case of mistaken identity 的文章，文中指出現(xiàn)已發(fā)表的 650 多項(xiàng)研究中所用的乳腺癌細(xì)胞可能并不是真正的乳腺癌細(xì)胞。

 

《Nature》于 2009 年發(fā)表了一篇以 Identity crisis 為題的社論文章，發(fā)表了一株細(xì)胞系約 18%-36% 的污染事件。時(shí)至今日，遭污染的細(xì)胞系已經(jīng)進(jìn)入上千家實(shí)驗(yàn)室，并且多家實(shí)驗(yàn)室發(fā)表的論文所使用的就是這一細(xì)胞系。

Josephine Nefkens 研究所的分子生物學(xué)家 Winand Dinjens 發(fā)現(xiàn)，在 13 株食管腺癌細(xì)胞系中，其中 3 株，SEG-1，BIC-1 和 SK-GT-5 被污染，這些細(xì)胞株混合有其他癌細(xì)胞。

科羅拉多大學(xué)的遺傳學(xué)家 Christopher Korch 發(fā)現(xiàn)，在過去 15 年期間，他發(fā)表的文章中有 78 株廣泛應(yīng)用的細(xì)胞系被證明受到了污染。 其中有兩株存在嚴(yán)重污染的"明星"細(xì)胞系。一個(gè)是 HEp-2 細(xì)胞系，有 5789 篇文章中使用的 HEP-2 存在 HELA 細(xì)胞的污染；另外一個(gè)是 INT 407 細(xì)胞系，有 1336 篇文章中使用的這種細(xì)胞系同樣受到了 HELA 細(xì)胞的污染。這篇題為 的文章發(fā)表 2015 年 雜志上。

此外，細(xì)胞機(jī)構(gòu)（ICLAC）在 2012 年建立了標(biāo)準(zhǔn)，并建立交叉污染數(shù)據(jù)庫，和鑒定錯(cuò)誤的細(xì)胞系。

《Nature》宣布從 2015 年 5 月 1 日起，Nature 及子刊文章所用細(xì)胞需要審查。

對(duì)于大多數(shù)細(xì)胞來說，可通過 DNA 測(cè)序或 STR 技術(shù)來鑒定細(xì)胞系是否被污染。

3. 如何預(yù)防污染

對(duì)于細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室來說，重要的是杜絕一切可能的污染源。污染的來源可分為直接和間接兩類。直接污染指使用試劑帶來的污染或者所培養(yǎng)的細(xì)胞已經(jīng)被污染。間接污染可能來自于實(shí)驗(yàn)室、實(shí)驗(yàn)設(shè)備或者我們自己本身。因此如何預(yù)防污染的發(fā)生是細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室日常工作的重中之重。

如果實(shí)驗(yàn)室引入一種新的細(xì)胞，或者一直培養(yǎng)保存的細(xì)胞，但對(duì)保存細(xì)胞從未檢測(cè)過，就有可能給實(shí)驗(yàn)室?guī)砦廴?。因此使用前先檢測(cè)新引入細(xì)胞株，或檢測(cè)保存細(xì)胞是否純凈無污染。

對(duì)于培養(yǎng)基等試劑的選擇，必須在符合 GMP/GLP 規(guī)定的廠房生產(chǎn)，并且需要對(duì)血清進(jìn)行常規(guī)污染檢測(cè)，以及建立良好的分裝習(xí)慣和體系。

而且實(shí)驗(yàn)室是否保持潔凈，實(shí)驗(yàn)設(shè)備是否保持無菌，以及操作環(huán)節(jié)的正確操作，都可避免污染產(chǎn)生。因此必須遵照嚴(yán)格的無菌操作規(guī)范和管理。

1) CO2 培養(yǎng)

選擇具有無風(fēng)扇設(shè)計(jì)、一體成型的培養(yǎng)箱體，便于清潔，并大大減少污染源。其次可能的話 ，使用具有自動(dòng)滅菌功能培養(yǎng)箱，即銅質(zhì)箱體。

對(duì)于日常使用來說，至少每月清潔培養(yǎng)箱一次，并盡量減少門打開次數(shù)，避免對(duì)溫度、培養(yǎng)基中 pH 值調(diào)節(jié)的影響。

2) 合適的移液工具

如果移液操作過程誤操作，那么分裝樣品有可能存在污染。因此選擇合適的移液器和高品質(zhì)耗材，是確保分裝樣品潔凈的保證。跟實(shí)驗(yàn)室常用的雙按鈕移液器相比，單按鈕移液器能更好的減少氣溶膠污染，因?yàn)閱伟粹o移液器打出吸頭時(shí)活塞無需回彈，而且直接按下去。

3) 具有生物安全柜功能的濾芯吸頭

移液操作中除移液器外，還可通過使用濾芯吸頭來降低氣溶膠污染。Eppendorf 的濾芯吸頭具有兩層濾芯和不同孔徑，確保超高的阻隔效率。 其濾芯性能符合 EN 1822 標(biāo)準(zhǔn) (空氣過濾的級(jí)別)，具有 HEPA E12 級(jí)的過濾性能。

4) 使用培養(yǎng)瓶培養(yǎng)細(xì)胞，尤其是透氣蓋培養(yǎng)瓶

相比培養(yǎng)皿或培養(yǎng)板，培養(yǎng)瓶只有瓶口可以與外界聯(lián)通，因此減少外界氣體及微生物與培養(yǎng)細(xì)胞接觸，減少污染幾率。具有濾膜的透氣瓶蓋，可更加有效的防止細(xì)菌、病毒，以及支原體等的污染。Eppendorf 培養(yǎng)瓶透氣蓋的濾膜具有多種孔徑，且瓶蓋可側(cè)立放置，有效地阻隔微生物及氣溶膠污染。

5) 可重復(fù)密封的包裝

細(xì)胞培養(yǎng)耗材必須是無菌、無熱源的，因此能夠重復(fù)密封的耗材包裝是未使用耗材無菌保存的保證。Eppendorf 細(xì)胞培養(yǎng)耗材具有重復(fù)密封、可壓縮的包裝，無需工具便可方便打開或密封，確保產(chǎn)品無菌，并提高實(shí)驗(yàn)室管理。