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雙特異性抗體是指能同時(shí)特異性結(jié)合兩個(gè)抗原或抗原表位的人工抗體。雙特異性抗體在自然條件下并不存在,而是通過細(xì)胞融合或重組DNA技術(shù)制備實(shí)現(xiàn)的。由于其特異性和雙功能性,現(xiàn)已成為抗體工程領(lǐng)域的研究熱點(diǎn),在腫瘤治療及自身免疫病等領(lǐng)域中具有廣闊的應(yīng)用前景。截止到2023年9月份,全球已獲批13款雙抗藥物(包括已退市的),從2022年初到現(xiàn)在就獲批了9款藥物(表1)。獲批的雙抗藥物涉及的靶點(diǎn)多樣,包括CD3、CD19、EGFR、cMET、PD-1、CTLA-4和BCMA等,探索的適應(yīng)癥包括血液瘤、多發(fā)性骨髓瘤、血友病和非小細(xì)胞肺癌等。表1. 獲批上市的雙抗藥物

鑒于雙抗藥物潛在的療效和安全性優(yōu)勢(shì),國(guó)內(nèi)外企業(yè)紛紛布局雙抗領(lǐng)域,國(guó)內(nèi)共有300余款雙抗在研藥物,其中進(jìn)入臨床階段的藥物近100款??捣缴?、康寧杰瑞、百濟(jì)神州、恒瑞醫(yī)藥、信達(dá)生物、貝達(dá)藥業(yè)、澤璟制藥等深耕于雙抗賽道。其中,康方生物的卡度尼利是上市的國(guó)產(chǎn)雙抗藥物,今年有望納入醫(yī)保。由于工程化雙抗擁有兩個(gè)不同的抗原結(jié)合臂,致使其生產(chǎn)制備變成了一個(gè)復(fù)雜且具有挑戰(zhàn)性的過程。具體挑戰(zhàn)包括:正確的鏈配對(duì)、同源二聚體污染、產(chǎn)量、正確的蛋白質(zhì)折疊和翻譯后修飾。以抗體設(shè)計(jì)為主導(dǎo)的解決方案和創(chuàng)新工藝技術(shù)的結(jié)合使得克服其中許多挑戰(zhàn)成為可能,但雙抗生產(chǎn)的復(fù)雜過程特別需要強(qiáng)大且可靠的表達(dá)平臺(tái),包括:表達(dá)載體:理想表達(dá)載體將目標(biāo)分子所有鏈以比例進(jìn)行基因組整合和表達(dá)。盡管多表達(dá)盒載體可以提供便利,但將雙特異性抗體的每一半引入單獨(dú)的載體中,微調(diào)它們各自的表達(dá)水平亦可實(shí)現(xiàn)配對(duì)。細(xì)胞系:工程化雙特異性抗體的表達(dá)需要強(qiáng)大的宿主細(xì)胞系,廣泛使用的為中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞CHO,因?yàn)樗粌H需要有效的鏈配對(duì),還需要正確的翻譯后修飾、折疊和分泌。早期質(zhì)量篩選:細(xì)胞池和克隆篩選過程中的早期質(zhì)量分析有助于評(píng)估鏈配對(duì)效率、折疊模式和潛在的聚集風(fēng)險(xiǎn)。工藝優(yōu)化:即使使用優(yōu)化的細(xì)胞系和載體,同源二聚化仍然是雙特異性生產(chǎn)的潛在障礙。通過優(yōu)化細(xì)胞培養(yǎng)過程和純化策略,提高所需分子的產(chǎn)量。本案例以最新的轉(zhuǎn)座子載體為載體平臺(tái),嘗試在業(yè)界推崇的GS 敲除的CHO細(xì)胞中表達(dá)不對(duì)稱 4 鏈雙特異性抗體。以獲得高表達(dá)且正確組裝的異二聚體構(gòu)象為目標(biāo),檢測(cè)CHOSOURCE™蛋白表達(dá)平臺(tái)對(duì)雙抗細(xì)胞株構(gòu)建的表現(xiàn)。
CHOSOURCE™蛋白表達(dá)平臺(tái)簡(jiǎn)介
瑞孚迪(Revvity) 公司旗下的CHOSOURCE™蛋白表達(dá)平臺(tái)匯集了強(qiáng)大的谷氨酰胺合成酶敲除 (GS KO) 的CHO 細(xì)胞和巖藻糖轉(zhuǎn)移酶敲除的ADCC+ CHO細(xì)胞系(可表達(dá)無巖藻糖基修飾的抗體蛋白)、轉(zhuǎn)座子載體技術(shù)。CHO細(xì)胞搭載轉(zhuǎn)座子載體用于高效表達(dá)單抗,融合蛋白等分子,已經(jīng)得到多組實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。轉(zhuǎn)座子技術(shù)帶來的目標(biāo)分子完整高效的基因組整合,顯著簡(jiǎn)化和加速了細(xì)胞系開發(fā)(CLD)流程。


圖 1. CHOSOURCE 蛋白平臺(tái)和CHOSOURCE 轉(zhuǎn)座子技術(shù). 轉(zhuǎn)座子技術(shù)是一個(gè)由轉(zhuǎn)座子載體和轉(zhuǎn)座酶mRNA組成的雙組分系統(tǒng)。轉(zhuǎn)座子載體本身含2個(gè)表達(dá)盒。目標(biāo)基因(GOIs)克隆至載體后,轉(zhuǎn)座酶通過識(shí)別載體上的末端反向重復(fù)序列(TIR),將含有GOIs(包括GS選擇盒)的序列整合到宿主細(xì)胞基因組中,實(shí)現(xiàn)目標(biāo)基因的高效完整整合此外,結(jié)合瑞孚迪的微流控毛細(xì)管電泳分析系統(tǒng)LabChip® GXII Touch™ ,可以實(shí)現(xiàn)快速的蛋白關(guān)鍵質(zhì)量屬性分析(純度,糖型,電荷異質(zhì)性等),將蛋白質(zhì)量分析納入生物治療工作流程早期,可以顯著提高細(xì)胞株構(gòu)建效率和質(zhì)量控制。
實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì):不對(duì)稱 4 鏈雙特異性抗體,由兩條輕鏈(LC1和LC2)和兩條重鏈(HC1和HC2)組成,采用knobs-into-holes結(jié)構(gòu)(圖2)。CHOSOURCE 轉(zhuǎn)座子技術(shù)由雙表達(dá)盒轉(zhuǎn)座子載體和轉(zhuǎn)座酶兩部分組成,因4鏈分子的表達(dá)需要2個(gè)載體,通過四條序列在2個(gè)載體上的不同配組得到8種載體和組合(圖3) ,兩載體間以1:1 比例同轉(zhuǎn)座酶 mRNA共轉(zhuǎn)染至 GS KO CHO宿主細(xì)胞中。

圖2. 使用CHOSOURCE 轉(zhuǎn)座子技術(shù)表達(dá)具有knobs-into-holes Fc區(qū)域的不對(duì)稱4-鏈雙特異性抗體[A]。正確的異二聚體抗體[A]會(huì)與一些不正確的鏈組合和自由鏈[B]共同表達(dá),雜質(zhì)種類復(fù)雜


圖 3. 使用 CHOSOURCE 載體表達(dá) 4 鏈雙特異性抗體,兩個(gè) 轉(zhuǎn)座子載體與 轉(zhuǎn)座酶 mRNA 共轉(zhuǎn)染GS KO 的CHO 細(xì)胞。圖示本測(cè)試中構(gòu)建的8個(gè)不同的載體, 8種不同轉(zhuǎn)染組合條件下各個(gè)載體的配組情況
實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
-
細(xì)胞池篩選恢復(fù)和整合拷貝數(shù)分析
轉(zhuǎn)染后無需選擇劑甲硫氨酸亞砜亞胺(MSX),6個(gè)組合的細(xì)胞池在8~13天即完成篩選恢復(fù),2個(gè)恢復(fù)慢的組合在16天時(shí)達(dá)到培養(yǎng)階段(圖4)?;謴?fù)時(shí)間的差距表明每個(gè)載體內(nèi)的抗體鏈位置對(duì)細(xì)胞池的選擇恢復(fù)有影響,這可能是由于不同位置的抗體鏈的表達(dá)水平不同。

圖4. 共轉(zhuǎn)染后細(xì)胞池的選擇恢復(fù)概況。圖(A)代表活細(xì)胞密度,圖(B)代表活力百分比。誤差線代表兩個(gè)獨(dú)立轉(zhuǎn)染細(xì)胞池的標(biāo)準(zhǔn)偏差評(píng)估每個(gè)細(xì)胞池中載體的整合情況(圖5),我們發(fā)現(xiàn)同一表達(dá)載體中的 HC 和 LC 及GS基因以 1:1:1 的比例整合到每個(gè)細(xì)胞池中。例如,在共轉(zhuǎn)染條件3中,載體1中LC1和HC1確定的拷貝數(shù)均為15,載體2中HC2和LC2確定的拷貝數(shù)為11,它們組合起來與觀察到的 GS 基因的 26 個(gè)拷貝相匹配。8個(gè)pool中GS 基因拷貝數(shù)基本等于兩個(gè)重鏈或輕鏈的所在載體拷貝數(shù)之和,同以往的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致,說明了 轉(zhuǎn)座酶介導(dǎo)完整的目標(biāo)序列轉(zhuǎn)座。

圖5. 不同轉(zhuǎn)染組合條件下目標(biāo)基因拷貝數(shù)插入情況。篩選恢復(fù)后每個(gè)共轉(zhuǎn)染組合條件下細(xì)胞池中四條目標(biāo)抗體序列(LC1、HC1、LC2、HC2)和篩選基因GS的插入拷貝數(shù)檢測(cè) (ddPCR方法,每個(gè)樣本三次重復(fù))由于兩載體以 1:1 的比例共轉(zhuǎn)染,預(yù)計(jì)每個(gè)庫(kù)中會(huì)整合相同數(shù)量的四個(gè)鏈拷貝。實(shí)際情況并非如此。僅轉(zhuǎn)染組合條件 4、7 和 8下,所有四個(gè)鏈的數(shù)量幾乎相等;在共轉(zhuǎn)染條件 1 中,含有“knobs”HC (HC2) 的載體比含有“holes”HC (HC1) 的載體整合更少的拷貝數(shù)(7:14;大約一半),這也意味著可以調(diào)整載體的比例,以增加特定分子的整合。
-
細(xì)胞池生產(chǎn)力和質(zhì)量評(píng)估
恢復(fù)后的8組測(cè)試細(xì)胞池經(jīng)14天的簡(jiǎn)單fed-batch培養(yǎng)(培養(yǎng)條件未優(yōu)化),初步評(píng)估哪個(gè)組合配置產(chǎn)能有優(yōu)勢(shì)。雙抗的產(chǎn)量數(shù)據(jù)顯示:具有相似拷貝數(shù)的六個(gè)共轉(zhuǎn)染池的抗體產(chǎn)量在相同范圍內(nèi),并且高于1g/L,而其余兩個(gè)池拷貝數(shù)最少,產(chǎn)量也較低(圖6)。“LC1HC1_HC2LC2”(共轉(zhuǎn)染條件 3)配置具有最高數(shù)量的整合拷貝,產(chǎn)生了最高的總體抗體滴度。

圖 6. 八個(gè)共轉(zhuǎn)染細(xì)胞池的雙抗生產(chǎn)力初步評(píng)估(14天fed-batch 培養(yǎng))使用微流控毛細(xì)管電泳LabChip GXII Touch HT 系統(tǒng),利用 ProteinEXact 試劑盒進(jìn)行八組載體配置下純化抗體的非還原和還原電泳分析,并與參考雙特異性抗體對(duì)照進(jìn)行比較(圖7,表2)。微流控毛細(xì)管電泳技術(shù)可以可以根據(jù)蛋白質(zhì)的大小,高效分離非還原樣品的不同構(gòu)象,如異二聚體、同二聚體、糖基化和非糖基化變體以及游離鏈等,速度達(dá)到~1分鐘/樣品,并具備靈活通量(1-384樣本/輪),對(duì)于分析還原樣品,可以實(shí)現(xiàn)單個(gè)抗體鏈的鑒定和定量。比較八個(gè)載體配置下蛋白電泳圖譜發(fā)現(xiàn)(圖7),雖然“LC1HC1_HC2LC2”(共轉(zhuǎn)染條件3)具有最高的抗體滴度,但表達(dá)的抗體譜與參考分子不同。共轉(zhuǎn)染生成該池的兩個(gè)載體內(nèi)兩條重鏈和輕鏈的前后位置導(dǎo)致 LC2 鏈表達(dá)減少,這可能妨礙了分子的正確組裝。結(jié)合還原蛋白電泳圖譜,“LC2HC1_LC1HC2”(共轉(zhuǎn)染條件 8)顯示出更多優(yōu)勢(shì),不僅峰型與對(duì)照分子相近,四個(gè)抗體鏈的存在比例與參考分子的比例也非常相似。

圖 7. LabChip GXII Touch HT 系統(tǒng)評(píng)估 8 個(gè)配組組合及參考雙抗的非還原和還原狀態(tài)下蛋白的μCE-SDS情況。非還原蛋白樣品的電泳圖譜如 [A] 所示。還原蛋白樣品的電泳圖譜見[B]圖,條形圖代表各條鏈的濃度百分比(%)利用LabChip GXII Touch HT的軟件細(xì)致分析“LC2HC1_LC1HC2”(共轉(zhuǎn)染條件 8)產(chǎn)生的抗體異構(gòu)體與參比分子的異同(表2),共轉(zhuǎn)染條件 8雖然表達(dá)滴度比條件 3 稍低(1.2g/L vs 1.4g/L),但構(gòu)象正確率達(dá)到94%。是這批實(shí)驗(yàn)中綜合表現(xiàn)良好的組合,鑒于產(chǎn)量和質(zhì)量評(píng)估對(duì)于確定細(xì)胞系開發(fā)流程中最佳細(xì)胞池同樣重要,共轉(zhuǎn)染條件 8得到的細(xì)胞池適合進(jìn)入下一步單克隆篩選 。表2. 對(duì)于LC2HC1_LC1HC2(共轉(zhuǎn)染條件 8)樣本抗體,微流控毛細(xì)管電泳中的各個(gè)峰相對(duì)于參考雙抗分子的蛋白質(zhì)量分析。[A,B] 非還原蛋白樣品的各峰比較, [C,D] 還原蛋白樣品的各峰比較

結(jié)論在這項(xiàng)工作中,我們使用 CHOSOURCE 轉(zhuǎn)座子載體技術(shù)表達(dá)不對(duì)稱 4 鏈雙特異性抗體。初次嘗試變獲得高表達(dá)且正確的異二聚體構(gòu)象是雙抗生產(chǎn)的目標(biāo)(條件8)。本研究只測(cè)定了兩種載體以 1:1 的共轉(zhuǎn)染比例產(chǎn)生的正確抗體構(gòu)型的情況,由于雙特異性抗體的基因組整合和表達(dá)的動(dòng)力學(xué)的復(fù)雜性,兩個(gè)載體還可以嘗試以不同的比例共轉(zhuǎn)染以產(chǎn)生更佳的正確的異二聚體配置。CHOSOURCE 轉(zhuǎn)座子技術(shù)雙盒載體提供了調(diào)節(jié)雙特異性抗體不同鏈表達(dá)的靈活性。這不僅可以通過測(cè)試兩個(gè)載體不同比例的共轉(zhuǎn)染來實(shí)現(xiàn),還可以通過測(cè)試不同的鏈位置來實(shí)現(xiàn)。CHOSOURCE 轉(zhuǎn)座子技術(shù)搭載 GS KO 細(xì)胞系,能夠在轉(zhuǎn)染后約6 周內(nèi)評(píng)估細(xì)胞池階段的蛋白質(zhì)質(zhì)量,鑒于轉(zhuǎn)座子帶來的完整高效整合,有助于高效實(shí)現(xiàn)CLD的開發(fā)。雙特異性抗體分子設(shè)計(jì)的進(jìn)步,例如knobs-into-holes 結(jié)構(gòu),顯著減少了錯(cuò)配和同源二聚體污染。然而,“孔-孔”同二聚體和共純化的游離鏈仍然存在挑戰(zhàn),故在細(xì)胞系開發(fā)過程的早期納入質(zhì)量分析變得很關(guān)鍵。瑞孚迪 的微流控毛細(xì)管電泳 LabChip GXII Touch HT 系統(tǒng),高效率分析還原和非還原樣本的多項(xiàng)蛋白表征(滴度,純度,電荷異質(zhì)性,片段化,聚體,糖基化程度及糖譜等),1分鐘/樣本的速度和1-384樣本/輪的靈活通量,可進(jìn)一步提高生物制品開發(fā)的速度。在本研究中,LabChip GXII Touch HT 系統(tǒng)可以對(duì)細(xì)胞池表達(dá)的抗體進(jìn)行快速表征分析,可以幫助在細(xì)胞系開發(fā)時(shí)及早識(shí)別最佳的細(xì)胞池。總之, 瑞孚迪 的 CHOSOURCE 表達(dá)平臺(tái)和 LabChip GXII Touch HT 系統(tǒng)的強(qiáng)強(qiáng)聯(lián)手,可以大簡(jiǎn)化和加速?gòu)?fù)雜抗體類分子的細(xì)胞系開發(fā)過程,促進(jìn)生物治療藥物的開發(fā)和進(jìn)步。