應(yīng)用優(yōu)勢：

■ 利用色譜和高選擇性的質(zhì)譜檢測提高 分析選擇性

■ 寬的動態(tài)范圍(范圍拓寬200倍)

■ 樣品制備過程簡單、經(jīng)濟，僅使用極少 量的樣品

■ 分析速度快

 

白消安是一種雙功能烷基化試劑，其生物利用度受個體年齡、疾病狀態(tài)和藥 物相互作用等因素的影響，在不同個體間差異極大1 。高準確度、高靈敏度且 高選擇性的分析方法可在白消安的藥代動力學和藥效動力學研究中發(fā)揮重要 作用。 本應(yīng)用紀要介紹了一種臨床研究方法，使用溶于甲醇的白消安-2 H8 內(nèi)標對血漿 樣品進行去蛋白處理，然后使用配備WatersTM ACQUITY UPLCTM HSS T3色譜 柱的ACQUITY UPLC I-Class系統(tǒng)進行色譜分離，所需時間僅2.5 min，后在 XevoTM TQD質(zhì)譜儀上進行檢測。 

 

實驗： LC條件 MS條件 數(shù)據(jù)管理 方法條件 白消安有證參比溶液及其穩(wěn)定同位素內(nèi)標(2 H8 )購自Qmx(英國艾塞克斯郡薩克斯泰德)。使用購自Golden West Biologicals(美國加利福 尼亞州特曼庫拉)的混合血漿作為替代基質(zhì)制備校準品。白消安的校準范圍為0.025～5 µg/mL。使用相同的混合血漿制備濃度為 0.05、0.75、1.5和3.5 µg/mL的QC樣品。

 

樣品萃?。合?0 µL樣品中添加250 µL溶于甲醇的 0.1 µmol/L內(nèi)標(ISTD)，旋渦混合30 s，在16100 g下離心2 min。然后取50 µL上清液添加到 950 µL水中配制成終萃取物用于UPLC-MS/MS分析。

實驗結(jié)果：在上述色譜條件下，白消安與磷脂實現(xiàn)了色譜分離。圖2是低濃度校準品和內(nèi)標的典型色譜圖。 在分析白消安濃度高達10 µg/mL的血漿樣品之后，未觀察到系統(tǒng)殘留污染。 分析靈敏度研究結(jié)果表明，該方法可以定量分析0.020 µg/mL的白消安(RSD < 20%，偏差< 15%)。 精密度評估試驗設(shè)計為五天內(nèi)每天萃取并定量分析四個不同濃度的QC樣品(每個濃度五個重復樣，n = 25)。通過分析各QC水平的五 個重復樣評估方法的重現(xiàn)性。表3顯示了這些實驗的結(jié)果，測定四個濃度水平的白消安的總精密度和重現(xiàn)性為RSD ≤ 7.3%。

將高濃度和低濃度白消安樣品按不同比例混合并進行分析，結(jié)果表明該方法在0.0175～6.51 µg/mL的范圍內(nèi)呈線性。 本研究評價了血漿中含有低濃度(0.05 µg/mL)和高濃度(3.5 µg/mL)白消安時的基質(zhì)效應(yīng)(n=6)。低濃度下的基質(zhì)因子為0.92～1.06(平 均值0.99)，而高濃度下的基質(zhì)因子為0.99～1.12(平均值1.08)。使用白消安內(nèi)標可補償這種基質(zhì)效應(yīng)，得到低濃度和高濃度下的基質(zhì)因 子分別為0.98～1.02(平均值0.99)和0.95～1.00(平均值0.98)。

 

通過在高/低濃度混合血漿樣品(0.05 µg/mL和3.5 µg/mL)中加入高濃度內(nèi)源性化合物(白蛋白、膽紅素、膽固醇、甘油三酸酯和尿酸) 和外源性物質(zhì)脂肪乳劑(20%乳化劑)，測定白消安的回收率(n = 3)。評估了這些物質(zhì)可能對分析造成的干擾，所得回收率范圍為 85.1%～106.1%。評估對乙酰氨基酚、氟康唑、酮康唑、伊曲康唑、苯妥英、泊沙康唑和伏立康唑?qū)Ψ治龅母蓴_作用，得到的回收率 范圍為93.2%～103.0%。導致回收率超出85%～115%范圍的物質(zhì)被視為干擾物。 采用該方法分析血漿樣品中白消安的濃度與采用另一種經(jīng)過驗證的LC-MS/MS方法所得的結(jié)果之間具有良好的相關(guān)性，Deming回歸 方程為y = 1.01x + 0.04(n = 40，濃度范圍0.02～2.28 µg/mL，

 

結(jié)論：本研究開發(fā)了一種高靈敏度、高選擇性的分析（Waters Xevo TQD 三重四極桿液相質(zhì)譜聯(lián)用儀）血漿中白消安的臨床研究方 法。 此分析方法的樣品制備過程快速、經(jīng)濟，僅使用50 µL樣品即可在低濃度的 (0.025 µg/mL)白消安分析中達到足夠的分析靈敏度，并表現(xiàn)出優(yōu)異的精密 度。 實驗證明該方法具有良好的線性，而且既無系統(tǒng)殘留又無基質(zhì)效應(yīng)。所得結(jié) 果與一種已建立的經(jīng)過驗證的LC-MS/MS方法所得的結(jié)果具有良好的一致 性。 此方法可用于確定濃度-時間曲線下累計面積(曲線下面積，AUC)，對于白消 安的藥代動力學和藥效動力學研究具有重要的應(yīng)用價值。 感謝曼徹斯特醫(yī)院(英國曼徹斯特)臨床生物化 學部門的Ed Hinchlie為本研究提供匿名血漿樣 品。