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技術(shù)文章

Agilent 1290生物液相色譜系統(tǒng)進(jìn)行高分離度 SEC 分析

閱讀:1052          發(fā)布時(shí)間:2021-8-24

摘要:本應(yīng)用簡(jiǎn)報(bào)介紹了配備 Agilent AdvanceBio SEC 色譜柱和超低擴(kuò)散毛細(xì)管的 Agilent 1290 Infinity II 生物液相色譜系統(tǒng)通過(guò)體積排阻色譜 (SEC) 分離蛋白質(zhì)的出色分離 度。生物兼容性 UHPLC 系統(tǒng)能夠使用腐蝕性鹽緩沖液進(jìn)行分析,因此節(jié)省了維護(hù) 費(fèi)用。比較了不同內(nèi)徑毛細(xì)管(0.17、0.12 和 0.07 mm)在 SEC 分析中的分離度。 對(duì)一種蛋白質(zhì)混標(biāo)和單克隆抗體 (mAbs)(包括聚集體)進(jìn)行了分離,并比較了分離 度。此外,由單一軟件解決方案中的 Agilent OpenLab GPC/SEC 附加軟件確定了分 子量,實(shí)現(xiàn)了一步式工作流程。


前言:mAbs 等現(xiàn)代生物藥物是高度異質(zhì)性的化 合物。聚集體是最重要的關(guān)鍵質(zhì)量屬性 (CQAs) 之一,通常采用 SEC 進(jìn)行監(jiān)測(cè)。 這項(xiàng)技術(shù)可根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品計(jì)算待測(cè)物分子 量,從而對(duì)化合物進(jìn)行鑒定。此外,該技 術(shù)還可通過(guò)顯示更高分子量的聚集體成分 (如二聚體和更高程度聚集體)來(lái)確認(rèn)純 度。為獲得足夠的分離度,推薦使用亞 2 µm 顆粒填充的現(xiàn)代 SEC 色譜柱。為 實(shí)現(xiàn)最佳性能,亞 2 µm 色譜柱和死 體積盡可能小的 UHPLC 儀器。死體積過(guò) 大會(huì)因擴(kuò)散效應(yīng)而損失這些色譜柱獲得 的分離度。此外,*生物兼容的 1290 Infinity II 生物液相色譜系統(tǒng)可以應(yīng)對(duì) SEC 緩沖液中常用的高濃度鹽,以維護(hù)成本提供可靠結(jié)果。 本應(yīng)用簡(jiǎn)報(bào)介紹了現(xiàn)代亞 2 µm SEC 色譜 柱在 1290 Infinity II 生物液相色譜系統(tǒng)上 的應(yīng)用,展示了使用死體積極小的儀器帶 來(lái)的優(yōu)勢(shì)。為證明死體積對(duì)蛋白質(zhì)和聚集 體分離的影響,使用了不同內(nèi)徑的毛細(xì) 管。將特征明確的 NISTmAb 通過(guò) pH 誘 導(dǎo)和熱誘導(dǎo)產(chǎn)


實(shí)驗(yàn)部分 儀器 • Agilent 1290 Infinity II 生物高速泵 (G7132A) • Agilent 1290 Infinity II 生物 Multisampler (G7137A),配備集成 式樣品恒溫箱(選件 #101) • Agilent 1290 Infinity II 高容量柱溫箱 (G7116B),配備生物兼容性熱交換器 • Agilent 1290 Infinity II 可變波長(zhǎng)檢測(cè)器 (G7114B),配備生物兼容性微量流通 池,3 mm,2 µL 其他部件 Agilent 1290 Infinity II 生物超低擴(kuò)散工具 包 (G7132A#006) 軟件 Agilent OpenLab 2.5 版和 GPC/SEC 附加 軟件 1.2 版

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色譜柱 Agilent AdvanceBio SEC 200 ?, 4.6 × 300 mm, 1.9 µm (部件號(hào) PL1580-5201) 樣品 • 校準(zhǔn)用蛋白質(zhì)混標(biāo)(部件號(hào) 5190- 9417):甲狀腺球蛋白 (670000 Da)、 γ-球蛋白 (150000 Da)、卵清蛋白 (45000 Da)、肌紅蛋白 (17000 Da)、 血管緊張素 II (1000 Da) • 人源化單克隆抗體 (mAb) 曲妥珠單 抗(商品名為赫賽?。┵?gòu)自 Roche (Basel, Switzerland)。曲妥珠單抗溶于 30 mmol/L 磷酸鹽緩沖液中,pH 6.8 • Agilent NISTmAb,人源化 IgG1κ mAb (部件號(hào) 5191-5745)


pH 誘導(dǎo)/溫度誘導(dǎo) NISTmAb 方案 使用流動(dòng)相將 mAb 稀釋至 2 mg/mL 的最 終濃度。pH 誘導(dǎo)方法與其他文獻(xiàn)所述基 本相同,僅有略微改動(dòng)[1]:將 1 mol/L HCl 溶液緩緩滴加到樣品溶液中,使其 pH 值 從 6.0 改變?yōu)?1.0。然后,滴加 1 mol/L NaOH 溶液將 pH 值調(diào)節(jié)至 10.0。最后, 再次滴加 1 mol/L HCl 溶液將 pH 值調(diào)回 6.0。pH 值變化間大約有 1 分鐘的等待時(shí) 間,期間持續(xù)緩慢攪拌溶液。將所得溶液 在 60 °C 下溫育 60 分鐘。 溶劑和化學(xué)品 • PBS:在 25 °C 下將 1 片 PBS 片溶于 200 mL 去離子水,得到 0.01 mol/L 磷酸鹽緩沖液、0.0027 mol/L 氯hua鉀、0.137 mol/L 氯化鈉,pH 7.4 • 化學(xué)品購(gòu)自德國(guó) VWR 公司 • 新制超純水產(chǎn)自配置 LC-Pak Polisher 和 0.22 µm 膜式終端過(guò)濾器 (Millipak) 的 Milli-Q Integral 水純化系統(tǒng)


結(jié)果與討論 用于蛋白質(zhì) SEC 分離的現(xiàn)代色譜柱中填 充亞 2 µm 顆粒,可實(shí)現(xiàn)最佳分離。而這 需要儀器具有優(yōu)化的低死體積,因?yàn)楦咚?體積特別是內(nèi)徑較大的毛細(xì)管會(huì)損失獲得 的分離度。1290 Infinity II 生物液相色譜 系統(tǒng)對(duì) 5 種蛋白質(zhì)混標(biāo)(包括 3 種二聚 體)的分離結(jié)果如圖 1A 所示。為了降低死體積和擴(kuò)散效應(yīng),我們使用了 內(nèi)徑 0.07 mm 的毛細(xì)管進(jìn)行分離。早洗 脫的甲狀腺球蛋白二聚體 (4.947 min) 實(shí) 現(xiàn)了部分分離。如需設(shè)置用于分子量測(cè)定 的校準(zhǔn),使用該混合物中的所有蛋白質(zhì)生 成校準(zhǔn)曲線(xiàn)(圖 1B)。獲得了四階最佳曲 線(xiàn)擬合。

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