摘要：我們開(kāi)發(fā)和驗(yàn)證了一種同時(shí)測(cè)定尼羅羅非魚(yú) (Oreochromis niloticus) 魚(yú)肉中 11 種不同類抗生素的方法。樣品預(yù)處理過(guò)程包括使用 5 g 魚(yú)肉、1 mL 0.1 M Na2EDTA 溶液和 24 mL乙腈：水（含 0.1% 甲酸）(70:30) 進(jìn)行提取，然后通過(guò) Captiva 小柱進(jìn)行純化。單次運(yùn)行中即可完成這些化合物的測(cè)定。所有化合物的定量限(LOQ) 均低于 4.3 µg/kg，回收率范圍為 83.8 - 110.1%，測(cè)量準(zhǔn)確度低于 5.5%。

前言世界上的水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)以每年約 9% 速度不斷在擴(kuò)大 [1]。在巴西，漁產(chǎn)品的增長(zhǎng)從 2007 年到 2009 年只有 60.2%，而羅非魚(yú)產(chǎn)量 7 年間卻增長(zhǎng)了 105% (2003–2009) [2]。這迫使水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)越來(lái)越多地依賴化學(xué)藥品的投入。由于放養(yǎng)密度很高，生物體間經(jīng)?；ハ喙羰軅?，導(dǎo)致化學(xué)藥品需求增加，尤其是抗生素。然而，漁產(chǎn)品進(jìn)口國(guó)如歐共體國(guó)家和美國(guó)，對(duì)抗生素殘留制定了越來(lái)越嚴(yán)格的*。由于藥物的濫用，動(dòng)物源性產(chǎn)品中的抗生素殘留頗受消費(fèi)者關(guān)注。這些殘留可能有毒性，也會(huì)使一些敏感個(gè)體發(fā)生過(guò)敏反應(yīng)。另外，長(zhǎng)期攝入食品中低劑量的抗生素也會(huì)導(dǎo)致耐藥微生物的蔓延。本研究介紹了一種采用 Captiva 小柱進(jìn)行化學(xué)過(guò)濾和 ESILC/MS/MS 分析的快速方法。Captiva 小柱（部件號(hào) A5300002）的主要優(yōu)點(diǎn)是可以非常簡(jiǎn)便高效地去除沉淀蛋白和顆粒物質(zhì)。為獲得更可靠的結(jié)果，使用氘代磺胺地托辛-d6 作為內(nèi)標(biāo)。根據(jù)歐盟委員會(huì)決議 2002/657/EC，對(duì)所開(kāi)發(fā)方法的選擇性、線性、準(zhǔn)確度、基質(zhì)效應(yīng)、精密度和靈敏度進(jìn)行了充分驗(yàn)證 [3]。

實(shí)驗(yàn)部分化學(xué)品所用溶劑甲醇和乙腈為 HPLC 級(jí) (Tedia)。所用試劑甲酸 (Vetec)和 Na2EDTA (Sigma-Aldrich) 均為分析級(jí)。每個(gè)化合物的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液 (100 µg/mL) 用甲醇制備，置于棕色瓶中，在 –20 °C 下可保存 6 個(gè)月。混標(biāo)工作液 (1000 µg/L) 通過(guò)用水適當(dāng)稀釋儲(chǔ)備液來(lái)制備，在低于 5 °C 的條件下保存，每周更新。樣品前處理將 5 g樣品置于 50 mL螺旋蓋聚四氟乙烯管中。加入 50 µL磺胺地托辛-d6 溶液 (1.0 µg/mL) 作為內(nèi)標(biāo)，然后加入 1 mL 0.1 M Na2EDTA溶液和 24 mL 乙腈：水（70: 30，含 0.1% 甲酸）混合溶劑。該混合物采用 Marconi ultraturrax 分散機(jī) (MA102) 混勻 5 min，然后采用Hitachi CF16RXII 離心機(jī)在 1370 xg 的離心力下離心 5 min。采用 Manifold Supelco Visiprep 系統(tǒng)，將 500 µL 上清液加入 CaptivaND 小柱（部件號(hào) A5300002）進(jìn)行洗脫，洗脫液收集在 2 mL 樣品瓶中，并采用 LC/MS/MS 進(jìn)行分析。

LC/MS/MS 方法液相色譜條件儀器 Agilent 1200 Infinity 系列液相色譜系統(tǒng)色譜柱 Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18（3 × 100 mm，3.5 µm）柱溫 30 °C流動(dòng)相 A) 0.1% 甲酸水溶液B) 0.1% 甲酸乙腈溶液梯度程序 時(shí)間 (min) %A %B0 95 513 5 95流速 0.4 mL/min進(jìn)樣量 10 µL質(zhì)譜條件儀器 Agilent 6430 三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)電離模式 ESI（正）干燥氣流速 10 L/min霧化器壓力 50 psi干燥氣溫度 350 °C毛細(xì)管電壓 4000 V軟件 Agilent Mass Hunter(B.03.01)檢測(cè)模式 多反應(yīng)監(jiān)測(cè) (MRM)驗(yàn)證和定量分析程序?qū)μ岢龅某绦蚺c歐盟委員會(huì)決議 2002/657/EC 標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行一致性的驗(yàn)證，主要考慮了以下參數(shù)：特異性、檢出限 (LOD) 定量限和LOQ、精密度以及回收率。在 5 - 400 µg/kg 范圍內(nèi)取 11 個(gè)目標(biāo)化合物的 7 個(gè)不同濃度，采用空白和加標(biāo)樣品進(jìn)行基質(zhì)匹配的校準(zhǔn) (MMC)。每個(gè)濃度平行分析三次。采用內(nèi)標(biāo)法測(cè)定樣品中目標(biāo)化合物的濃度。為獲得更可靠的結(jié)果，使用氘代磺胺地托辛-d6 作為內(nèi)標(biāo)。

通過(guò)加標(biāo)樣品中檢出分析物的量與加標(biāo)量的比值來(lái)計(jì)算回收率，以百分率表示。經(jīng)證實(shí)，所開(kāi)發(fā)的方法精度好、準(zhǔn)確度高，能可靠用于抗生素的測(cè)定。

結(jié)論本文詳述了尼羅羅非魚(yú)魚(yú)肉中選擇性測(cè)定不同種類抗生素的方法開(kāi)發(fā)。方法采用三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)，具有很高的準(zhǔn)確度、精密度和靈敏度。它可以對(duì)漁場(chǎng)中低至 ppb 級(jí)的目標(biāo)化合物進(jìn)行鑒定和定量分析。擬定的提取程序非常簡(jiǎn)單，樣品處理不需要附加凈化步驟即可獲得滿意回收率。