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小鼠脾臟樹突細胞的分離－塑料黏附和EA玫瑰花結(jié)富集DC
實驗材料：
1. 膠原酶消化的脾臟細胞懸液
2. 高密度牛血清白蛋白（BSA）溶液
3. RPMI 1640培養(yǎng)基（如Life Technologies），4℃和37℃
4. RPMI-5*培養(yǎng)基，4℃和37℃
5. 抗體偶聯(lián)的綿羊紅細胞（EA）
6. 用于流式細胞分析的一抗
7. 用于流式細胞分析的二抗（熒光結(jié)合的小鼠抗大鼠IgG和IgM；如Boehringer Mannheim）
8. Beckman GH-3.7和Sorvall HS-4轉(zhuǎn)子
9. 15ml和50ml聚丙烯錐底管
10. 填充棉花和未充填棉花的高壓滅菌的9in（約23cm）巴氏吸管，直徑60mm的組織培養(yǎng)皿（如Falcon）
實驗方法：
1. 將膠原酶消化的脾臟細胞懸液于4℃，280g離心10min，棄上清。用高密度BSA迅速重懸沉淀物，每個脾臟約1ml。
2. 準備BSA柱：將5-6ml細胞懸液加入15ml離心管中，在懸液上小心加入4℃ 1.5ml的RPMI-1640培養(yǎng)基，形成一明細界面。用此種方法準備4或5個BSA柱，直至分完細胞懸液。
3. 將BSA柱于4℃，9500g離心15min，緩慢加速，注意關(guān)掉“brake"開關(guān)。
4. 小心地用填充棉花的巴氏吸管收集分界面得細胞，吸走全部的RPMI-1640和頂部1ml BSA，將細胞轉(zhuǎn)移至另一干凈的50ml離心管中（棄沉淀）。用4℃的RPMI-1640充滿離心管以稀釋BSA，緩慢搖動混勻。
5. 于4℃，280g離心10min后棄上清。重懸細胞于5-10ml RPMI-5*培養(yǎng)基后置于冰上。
6. 臺盼藍染色計數(shù)活細胞（一個脾臟可得到107個低密度的脾臟細胞）。
7. 用RPMI-5*培養(yǎng)基調(diào)整細胞密度至大約107個細胞/ml。每4ml懸液接種至60mm培養(yǎng)皿內(nèi)直至全部細胞鋪板完畢。培養(yǎng)90min使DC粘附。
8. 棄非粘附細胞：用充填棉花的巴氏吸管吸取37℃ RPMI-1640培養(yǎng)基，小心清洗培養(yǎng)皿表面，去除懸浮的細胞，直至培養(yǎng)皿表面由粗糙渾濁變?yōu)楣饣⒔跚辶?。重?fù)洗滌一次。
9. 每個培養(yǎng)皿加入4ml 37℃ RPMI-1640培養(yǎng)基并培養(yǎng)30-60min以去除粘附的淋巴細胞。重復(fù)步驟8。
10. 于倒置顯微鏡下利用相差觀察培養(yǎng)皿。可見大部分深色星形樹突細胞、一些明亮扁平的巨噬細胞，以及淋巴細胞、單核細胞之類的圓形細胞。如果樹突細胞比例不高，則重復(fù)步驟8、9。
11. 用4ml干凈的RPMI-5*培養(yǎng)基替換每個培養(yǎng)皿中的液體，培養(yǎng)12-20h。
12. 用填充棉花的巴氏吸管吸取37℃ RPMI-5*培養(yǎng)基洗滌平皿。將洗下來的細胞轉(zhuǎn)移入置于冰上的15ml離心管中（每管可裝3個平皿的洗滌細胞）。用2ml RPMI-5*培養(yǎng)基洗滌平皿。重復(fù)該操作直到培養(yǎng)皿內(nèi)的細胞收集完畢。
13. 將收集的細胞于4℃，280g離心10min，棄上清。用1ml干凈的RPMI-5*培養(yǎng)基重懸細胞后置于冰上。
14. 臺盼藍染色計數(shù)活細胞（0.5×106-1.0×106個細胞/脾臟，約80%為DC）。
15. 按每個白細胞50個EA（抗體偶聯(lián)的綿羊紅細胞）的量加入EA（以結(jié)合B細胞和巨噬細胞），顛倒混勻。4℃，70g離心10min。離心后不棄上清，直接將離心管置于冰上30min。
16. 吸棄部分培養(yǎng)基，剩下2-2.5ml。用填充棉花的巴氏吸管輕微吹打細胞懸液10-15次以吹散大的團塊但是不破壞玫瑰花結(jié)。
17. 將重懸的細胞用血球計數(shù)器檢查以確認是否每個玫瑰花結(jié)都是一個白細胞周圍圍繞著紅細胞。如果有必要，再次懸浮細胞。
18. 制備BSA柱：將5ml高密度的BSA加入至15ml的離心管中，小心地將2.5ml玫瑰花結(jié)懸液加到液面上，從而形成一清晰地界面。
19. 離心并收集細胞同步驟3-6（2×105-7×105個細胞/脾臟，大于95%為DC）。
20. 用一抗標(biāo)記DC用流式細胞儀檢測其純度。對于二抗，用熒光結(jié)合的小鼠抗大鼠IgG和IgM。
附錄：
抗體偶聯(lián)的綿羊紅細胞（EA）：
以PBS洗滌2.5ml收集的綿羊紅細胞（Alsever液中提??；Cocalico）3次，每次洗滌后均以350g離心5min。然后用新鮮PBS稀釋為5%細胞懸浮液（109個細胞/ml）。將高致敏的兔抗紅細胞血清于5%細胞懸液以1：50稀釋（可能形成亞凝集劑量的抗體）。室溫下孵育2h，偶爾溫和地顛倒溶液。用RPMI1640（Life Technologies）洗滌形成的EA3次，隨后以PBS將EA稀釋為5%細胞懸液。于4℃保存2周，使用前再以RPMI洗滌一次。
RPMI-5*培養(yǎng)基：
RPMI1640培養(yǎng)基（Life Technologies），含有：
5%FBS，56℃熱滅活1h
10mmol/L HEPES
20mg/ml硫酸慶大霉素（Life Technologies）
50mmol/ml 2-ME
過濾除菌
高密度BSA溶液：
在1L容量瓶中，加入186ml PBS，29ml 1mol/L NaOH，65ml水（小心操作，注意液體不要再瓶內(nèi)飛濺）。不要攪拌，將106g BSA（Cohn fraction V，推薦采用*BSA）鋪在溶液表面，蓋上錫紙，冷藏過夜，使BSA慢慢溶解。
第二天，溫和搖晃已變?yōu)槌吻?、微褐色的溶液；測量折射指數(shù)，精確到小數(shù)點后第四位。25℃條件下，正確密度的BSA（1.080g/ml）的折射指數(shù)在1.384-1.385。為校正折射指數(shù)后，用試紙檢測pH。pH應(yīng)在7.0-7.4，一般無需調(diào)整。
無菌過濾溶液。將47mm濾膜（Millpore type）置于一個500ml的過濾裝置（Nalgene#156-4045）頂部，先以少量BSA潤濕濾膜。真空抽濾數(shù)分鐘，直到BSA濾出為止。取下真空泵，小心將剩余的BSA溶液加入濾器上部的儲存器中（避免起泡沫。使用真空泵和濾器過濾剩余的BSA，≥10min）。4℃可保存3個月。