空氣顆粒性污染物多環(huán)芳烴化合物SRM1649b相關(guān)分析

空氣顆粒性污染物多環(huán)芳烴化合物SRM1649b相關(guān)實驗分析方法：

1.多環(huán)芳烴化合物對表皮真皮細(xì)胞毒性效應(yīng)分析：永生化的皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞 HaCaT 細(xì)胞和皮膚成纖維細(xì)胞 NHDF 細(xì)胞為研究對象，以國際標(biāo)準(zhǔn)品空氣顆粒性污染物多環(huán)芳烴化合物 SRM1649b 浸出液為刺激物。研究不同時間條件下(0 小時、6 小 時、12 小時、24 小時，36 小時，48 小時）不同濃度 SRM1649b 對 HaCaT 細(xì)胞和 NHDF 細(xì)胞增殖活性的影響。傳代 HaCaT 細(xì)胞和 NHDF 細(xì)胞，顯微鏡下觀察有 70-80%的細(xì)胞 融合時用于實驗，吸去原培養(yǎng)液，加入專用培養(yǎng)基，稀釋 SRM1649b，使其終濃度為 (0、50、100、200、400ug/mL)，在不同濃度，不同時間條件下避光孵育，用 CCK8 法檢測不同時間點和濃度孵育 SRM1649b 對 HaCaT 細(xì)胞和 NHDF 細(xì)胞增殖活性的影響； 從而探索出不同濃度，和不同時間點 SRM1649b 浸出液對 HaCaT 及 NHDF 細(xì)胞生存率 的影響并選擇適宜的實驗濃度。

2. 采用流式細(xì)胞術(shù)檢測 SRM1649b 對 HaCaT 和 NHDF 的細(xì)胞周期，及凋亡的影響。 采用細(xì)胞免疫熒光法觀察 空氣顆粒性污染物多環(huán)芳烴化合物 SRM1649b 浸出液刺激前后 HaCaT 和 NHDF 細(xì)胞內(nèi)芳香族化 合物受體 AhR 的分布變化；

3. 用實時熒光定量 PCR 方法檢測各濃度實驗組 HaCaT 和 NHDF 細(xì)胞中基質(zhì)金屬 蛋白酶 MMP1，MMP3，MMP9 的 mRNA 表達(dá)情況。用 Western-blot 方法檢測各濃度實驗 組 HaCaT 和 NHDF 細(xì)胞中基質(zhì)金屬蛋白酶 MMP1 蛋白表達(dá)情況。用 ELISA 法檢測基質(zhì) 金屬蛋白酶 MMP1 蛋白的細(xì)胞外分泌情況；

4. 實時熒光定量 PCR 和 Western-blot 方法檢測 PAHs（SRM1649b 浸出液）與受 體（AhR）結(jié)合后引起的胞漿及核內(nèi)下游靶基因的變化，包括 ERK1/2, c-Jun 等調(diào)控 分子的磷酸化水平，以及 CYP1A1 等下游靶基因的 mRNA 表達(dá)水平；

5. 空氣顆粒性污染物多環(huán)芳烴化合物 SRM1649b分析加入 AhR 受體拮抗劑后對 HaCaT 和 NHDF 中 MMP1，CYP1A1 等表 達(dá)的影響。

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