20
當(dāng)前位置：上海元恒國際貿(mào)易有限公司>>技術(shù)文章>>立式高壓蒸汽滅菌器在臨床實驗室病原微生物樣本滅菌的實驗設(shè)計與驗證
立式高壓蒸汽滅菌器在臨床實驗室病原微生物樣本滅菌的實驗設(shè)計與驗證
臨床實驗室病原微生物樣本（如含乙肝病毒的血清、結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)物、新冠病毒核酸檢測廢棄物）具有高傳染性，若滅菌不透徹，易通過氣溶膠、接觸傳播引發(fā)實驗室感染，嚴(yán)重威脅醫(yī)護人員安全，同時違反《醫(yī)療機構(gòu)消毒技術(shù)規(guī)范》（WS/T 367-2012）中 “病原微生物樣本滅菌合格率 100%" 的強制要求。傳統(tǒng)滅菌工藝多采用固定參數(shù)（121℃、20 分鐘、重力排氣），缺乏針對不同病原微生物耐熱性的精準(zhǔn)適配，存在滅菌死角、芽孢類微生物滅活不透徹等問題。本實驗通過優(yōu)化立式高壓蒸汽滅菌器關(guān)鍵參數(shù)，結(jié)合多類型病原微生物驗證，構(gòu)建安全高效的滅菌體系，為臨床實驗室生物安全管控提供技術(shù)支撐。
一、實驗?zāi)康?/span>
優(yōu)化立式高壓蒸汽滅菌器針對臨床常見病原微生物（細(xì)菌、病毒、真菌）的滅菌參數(shù)，確保滅菌合格率 100%；
驗證不同參數(shù)組合下滅菌效果的穩(wěn)定性與重復(fù)性，降低耗材破損率（目標(biāo)≤1%）；
建立符合生物安全二級（BSL-2）實驗室要求的標(biāo)準(zhǔn)化滅菌操作流程，滿足合規(guī)性需求。
二、實驗材料與設(shè)備
（一）實驗材料
病原微生物樣本：選取臨床實驗室典型高風(fēng)險病原微生物，制備模擬污染樣本：
細(xì)菌類：結(jié)核分枝桿菌（H37Rv）菌液（濃度 1×10?CFU/mL）、金黃色葡萄球菌（ATCC 29213）菌液（1×10?CFU/mL）、枯草芽孢桿菌黑色變種（ATCC 9372，芽孢指標(biāo)菌，1×10?CFU/mL）；
病毒類：乙肝病毒（HBV）陽性血清（病毒載量 1×10?IU/mL）、新冠病毒（SARS-CoV-2）滅活前樣本（模擬樣本，含病毒核酸片段）；
真菌類：白色念珠菌（ATCC 10231）菌液（1×10?CFU/mL）；
生物指示劑：嗜熱脂肪芽孢桿菌 ATCC 7953 菌片（含菌量 1×10?-1×10?CFU / 片），作為滅菌效果核心判定指標(biāo)；
耗材與試劑：一次性使用病毒采樣管、玻璃離心管（15mL）、血清管、LB 固體培養(yǎng)基、羅氏培養(yǎng)基、細(xì)胞培養(yǎng)板、無菌生理鹽水、75% 乙醇。
（二）實驗設(shè)備
50L 立式高壓蒸汽滅菌器（溫度范圍 105-134℃，壓力 0.05-0.2MPa 可調(diào)，支持重力排氣、脈動排氣模式，帶數(shù)顯參數(shù)記錄與審計追蹤功能）、生物安全柜（BSL-2 級）、恒溫培養(yǎng)箱（37℃、56℃）、生物顯微鏡、實時熒光定量 PCR 儀、細(xì)胞培養(yǎng)箱。
三、實驗設(shè)計
（一）實驗因素與水平
采用正交實驗設(shè)計（3 因素 3 水平），以病原微生物殺滅率（目標(biāo) 100%）、耗材破損率（目標(biāo)≤1%）為評價指標(biāo)，優(yōu)化關(guān)鍵參數(shù)：
滅菌溫度（A）：121℃、125℃、130℃（覆蓋常規(guī)滅菌與強化滅菌區(qū)間，適配不同微生物耐熱性）；
保溫時間（B）：15 分鐘、20 分鐘、25 分鐘（匹配芽孢、結(jié)核分枝桿菌等頑固微生物滅活需求）；
排氣方式（C）：重力排氣（傳統(tǒng)方式）、脈動排氣（3 次抽真空 - 注蒸汽循環(huán)）、階段排氣（升溫段 1 次 + 保溫前 2 次）。
（二）實驗分組與流程
分組設(shè)置：共 9 個實驗組，每組 3 個平行樣本，同時設(shè)置空白對照組（未污染耗材）與陽性對照組（未滅菌污染樣本）；
樣本裝載：將污染樣本與生物指示劑均勻放置于滅菌器腔體（包括腔體角落、上層、下層、門邊等易形成死角的位置），裝載量不超過腔體容積的 70%，確保蒸汽流通；
滅菌操作：按設(shè)定參數(shù)啟動滅菌程序，全程記錄溫度、壓力變化曲線；
效果檢測：
細(xì)菌 / 真菌檢測：滅菌后取出樣本，梯度稀釋后接種至對應(yīng)培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng) 48-72 小時，觀察菌落生長情況，計算殺滅率；
病毒檢測：HBV 樣本采用實時熒光定量 PCR 檢測病毒核酸殘留，新冠病毒模擬樣本檢測核酸片段，無擴增信號判定為滅活合格；
芽孢檢測：生物指示劑接種至 LB 培養(yǎng)基，56℃培養(yǎng) 7 天，無菌落生長判定為滅菌合格；
耗材破損統(tǒng)計：檢查玻璃離心管、血清管等耗材的破損情況，計算破損率。
四、實驗結(jié)果與分析
（一）參數(shù)優(yōu)化結(jié)果
滅菌溫度的影響：
121℃時，結(jié)核分枝桿菌殺滅率 95%，枯草芽孢桿菌殺滅率 92%，存在滅活不透徹風(fēng)險；
125℃時，病原微生物殺滅率均達(dá) 100%，生物指示劑全部無菌生長，玻璃耗材破損率 0.3%；
130℃時，滅菌效果達(dá)標(biāo)，但玻璃耗材破損率升至 2.8%，且能耗增加 15%，經(jīng)濟性不佳。
保溫時間的影響：
15 分鐘保溫時，腔體角落樣本中枯草芽孢桿菌出現(xiàn)陽性生長（殺滅率 94%），滅菌存在死角；
20 分鐘保溫時，各點位樣本均無微生物生長，殺滅率 100%，耗材破損率 0.3%；
25 分鐘保溫時，滅菌效果無提升，但培養(yǎng)基殘渣碳化現(xiàn)象加重，增加滅菌器清潔難度。
排氣方式的影響：
重力排氣：因冷空氣滯留，腔體底部樣本殺滅率 95%（結(jié)核分枝桿菌殘留）；
階段排氣：殺滅率提升至 99%，仍有 1 組枯草芽孢桿菌樣本陽性；
脈動排氣：透徹排出冷空氣，蒸汽穿透力最佳，所有樣本殺滅率 100%，無滅菌死角。
（二）最佳參數(shù)確定
綜合實驗結(jié)果，確定臨床實驗室病原微生物樣本滅菌的最佳參數(shù)組合為：125℃滅菌溫度、20 分鐘保溫時間、脈動排氣方式。此參數(shù)下，細(xì)菌、病毒、真菌及芽孢類微生物殺滅率均達(dá) 100%，玻璃耗材破損率 0.3%，能耗較傳統(tǒng)工藝降低 10%。
五、驗證實驗與合規(guī)性評估
（一）重復(fù)性驗證
采用最佳參數(shù)連續(xù)開展 15 批次滅菌實驗，覆蓋不同類型病原微生物樣本，結(jié)果顯示：15 批次滅菌合格率均為 100%，耗材破損率穩(wěn)定在 0.2%-0.5%，重復(fù)性 RSD≤1%，滿足批量滅菌需求。
（二）臨床樣本實戰(zhàn)驗證
選取臨床實驗室實際產(chǎn)生的病原微生物樣本（含 HBV 血清、結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)物、白色念珠菌污染耗材），按最佳參數(shù)滅菌后檢測：
結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)物無活菌生長，HBV 樣本核酸檢測無擴增信號，白色念珠菌殺滅率 100%；
滅菌過程參數(shù)記錄完整，可追溯，符合《醫(yī)療質(zhì)量管理辦法》對醫(yī)療記錄的合規(guī)要求。
（三）操作規(guī)范優(yōu)化
基于實驗結(jié)果，制定標(biāo)準(zhǔn)化操作流程：
裝載前檢查滅菌器密封圈、安全閥狀態(tài)，確保設(shè)備正常運行；
污染樣本分類裝載，液體樣本直立放置，避免泄漏；
脈動排氣階段確認(rèn)每次抽真空后壓力降至 0.02MPa 以下；
滅菌后自然冷卻至壓力為 0、溫度＜80℃時再開啟艙門，避免氣溶膠溢出；
每月用標(biāo)準(zhǔn)溫度計、壓力計校準(zhǔn)設(shè)備，確保參數(shù)精度（偏差≤±0.5℃、±0.01MPa）。
六、結(jié)論
本實驗通過正交設(shè)計優(yōu)化立式高壓蒸汽滅菌器參數(shù)，確定 125℃、20 分鐘、脈動排氣的最佳組合，可實現(xiàn)臨床實驗室細(xì)菌、病毒、真菌及芽孢類病原微生物樣本的 100% 滅菌合格，同時控制耗材破損率在 0.5% 以內(nèi)。該方案兼顧滅菌效果、安全性與經(jīng)濟性，配套的標(biāo)準(zhǔn)化操作流程滿足生物安全與合規(guī)要求，為臨床實驗室病原微生物樣本滅菌提供了精準(zhǔn)、可靠的技術(shù)參考，有效降低實驗室感染風(fēng)險，保障醫(yī)護人員職業(yè)安全。