甲型流感病毒H1N1亞型雙重探針?lè)╭RT-PCR試劑盒

Influenza Virus A H1N1 Duplex Probe qRT-PCR Kit

使用手冊(cè)V1.0

產(chǎn)品及特點(diǎn)

流感病毒分為甲、乙、丙三型，其中甲型流感病毒最容易發(fā)生變異，流感大流行就是甲型流感病毒出現(xiàn)新亞型或舊亞型重現(xiàn)引起的。甲型流感病毒是A型流感病毒，根據(jù)H和N抗原不同，又分為許多亞型，H可分為18個(gè)亞型(H1~H18)，N可分為11個(gè)亞型(N1~N11)。其中導(dǎo)致人類(lèi)感染甲型流感病毒主要是H1N1。人感染甲型流感病毒后的早期癥狀與普通流感相似，包括發(fā)熱、咳嗽、喉痛、身體疼痛、頭痛、發(fā)冷和疲勞等，有些還會(huì)出現(xiàn)腹瀉或嘔吐、肌肉痛或疲倦、眼睛發(fā)紅等。由于人群對(duì)甲型流感病毒普遍易感，并可以人傳染人，因此快速檢測(cè)甲型流感病毒H1N1亞型對(duì)甲型流感病毒的及早發(fā)現(xiàn)，避免其大范圍傳播具有重要意義。本產(chǎn)品就是以探針法qRT-PCR技術(shù)為基礎(chǔ)開(kāi)發(fā)的對(duì)甲型流感病毒H1亞型和N1亞型的分型檢測(cè)的試劑盒，它具有下列特點(diǎn)：

1.                      即開(kāi)即用，用戶(hù)只需要提供樣品RNA模板。

2.                      引物和探針經(jīng)過(guò)優(yōu)化，分析靈敏性高，可以達(dá)到100拷貝/反應(yīng)。

3.                      提供陽(yáng)性對(duì)照，便于排除假陰性結(jié)果。

4.                      特異性高，引物和探針?lè)謩e根據(jù)甲型流感病毒H1亞型和N1亞型RNA高度保守區(qū)設(shè)計(jì)，不會(huì)跟其他生物的RNA發(fā)生交叉反應(yīng)。

5.                      既可用于定性檢測(cè)，又可用于定量檢測(cè)。用于定量檢測(cè)時(shí)線(xiàn)性范圍至少為5個(gè)數(shù)量級(jí)。

6.                      兩個(gè)探針?lè)謩e用FAM和HEX標(biāo)記，檢測(cè)和分型同時(shí)完成。

7.                      本產(chǎn)品足夠50次20 mL體系的探針?lè)≧T-PCR反應(yīng)。

8.                      本產(chǎn)品只能用于科研。

規(guī)格及成分

本產(chǎn)品使用十孔盒包裝

注意：引物-探針干粉在使用前需要短暫離心，然后在離心管中加入220 mL的超純水充分混勻后再使用，未用完的需要-20℃保存。本試劑盒采用DNA作為陽(yáng)性對(duì)照，不能有效監(jiān)控核酸純化和RT過(guò)程。如果需要RNA模板，需要另外定做。

運(yùn)輸及保存

低溫運(yùn)輸，-20℃保存，保存期限為12個(gè)月。

自備試劑

樣品RNA，超純水

使用方法

一、       稀釋甲型流感病毒H1亞型檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)樣品（以陽(yáng)性對(duì)照10E1-10E6拷貝/mL這6個(gè)10倍稀釋度）。由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行，千萬(wàn)不能污染樣品或本試劑盒的其他成分。

1.                      標(biāo)記6個(gè)離心管，分別為A6，A5，A4，A3，A2，A1。

2.                      在A(yíng)1-A6號(hào)管中各加入45 mL熒光PCR專(zhuān)用模板稀釋液。

3.                      在A(yíng)6號(hào)管中加入5 mL 1×10E7拷貝/mL的陽(yáng)性對(duì)照（試劑盒提供），充分震蕩1分鐘，得1×10E6拷貝/mL的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)PC樣品。放冰上待用。

4.                      換槍頭，在A(yíng)5號(hào)管中加入5 mL 1×10E6拷貝/mL的陽(yáng)性對(duì)照（上步稀釋所得），充分震蕩1分鐘，得1×10E5拷貝/mL的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)樣品。放冰上待用。

5.                      換槍頭，在A(yíng)4號(hào)管中加入5 mL 1×10E5拷貝/mL的陽(yáng)性對(duì)照（上步稀釋所得），充分震蕩1分鐘，得1×10E4拷貝/mL的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)樣品。放冰上待用。

6.                      重復(fù)上面的操作得到A1-A6共六個(gè)稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)陽(yáng)性樣品。放冰上待用。

二、稀釋甲型流感病毒N1亞型檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)樣品

7.                      操作同上，只是使用甲型流感病毒N1亞型的PC作為模板。得到6個(gè)濃度的樣本放冰上待用，分別是B1-B6。

三、樣品RNA的制備

8.                      如果有N個(gè)樣品，最好設(shè)置N+3個(gè)提取，多出的一個(gè)是甲型流感病毒H1亞型的PC（樣品制備陽(yáng)性對(duì)照），一個(gè)是甲型流感病毒N1亞型的PC（樣品制備陽(yáng)性對(duì)照），一個(gè)是NC（樣品制備陰性對(duì)照）?？梢杂?0 mL第一步和第二步所得的4號(hào)稀釋液再加上一定量的水使總體積跟樣本制備試劑盒所要求的起始樣本體積一樣，以此分別作為兩個(gè)PC。另外用水作為NC，水的總體積需要跟樣本制備試劑盒所要求的樣本體積一樣。注意：本試劑盒采用DNA作為陽(yáng)性對(duì)照，不能有效監(jiān)控核酸純化和RT過(guò)程。如果需要RNA模板，需要另外定做。

9.                      用自選方法純化樣品的RNA。本試劑盒跟市場(chǎng)上大多數(shù)RNA提取試劑盒兼容，也可以選購(gòu)本公司的免提取核酸釋放劑。

三、Probe qRT-PCR反應(yīng)（20 mL體系，在樣品制備室進(jìn)行）

10.                      如果做定量分析并且只做1次重復(fù)，則標(biāo)記N+3+1+6+6個(gè)RT-PCR管，其中N+3個(gè)用于上步得到的N+3個(gè)樣品，1個(gè)用于RT-PCR陰性對(duì)照（用水做模板），6個(gè)用于甲型流感病毒H1亞型的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，另外6個(gè)用于甲型流感病毒N1亞型的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。如果做定性分析并且只做1次重復(fù)，則標(biāo)記N+3+3個(gè)RT-PCR管，其中N+3個(gè)用于上步得到的N+3個(gè)樣品，1個(gè)用于RT-PCR陰性對(duì)照（用水做模板），1個(gè)用于甲型流感病毒H1亞型RT-PCR陽(yáng)性對(duì)照，1個(gè)用于甲型流感病毒N1亞型RT-PCR陽(yáng)性對(duì)照（直接用第一步和第二步所得的兩個(gè)4號(hào)稀釋液作為模板）。下面只以定量分析為例描述操作步驟。

11.                      在標(biāo)記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復(fù)）：

12.                      蓋上蓋子后上機(jī)，按下面參數(shù)進(jìn)行RT-PCR：

四、數(shù)據(jù)處理

13.                      如果擴(kuò)增陽(yáng)性對(duì)照或制備陽(yáng)性對(duì)照結(jié)果為陰性，則整個(gè)擴(kuò)增或制備實(shí)驗(yàn)無(wú)效，不需要分析數(shù)據(jù)，需要重做擴(kuò)增或制備或跟廠(chǎng)家聯(lián)系。如果擴(kuò)增陰性對(duì)照或制備陰性對(duì)照結(jié)果為陽(yáng)性，說(shuō)明環(huán)境污染，則整個(gè)擴(kuò)增或制備實(shí)驗(yàn)無(wú)效，不需要分析數(shù)據(jù)，需要跟廠(chǎng)家聯(lián)系，購(gòu)買(mǎi)新的引物和探針。

14.                      如果陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照正常，則實(shí)驗(yàn)有效，可以進(jìn)入后續(xù)分析。

15.                      對(duì)定量檢測(cè)，以標(biāo)曲樣本濃度的log值為橫軸，分別以甲型流感病毒H1亞型陽(yáng)性對(duì)照（FAM通道）和甲型流感病毒N1亞型陽(yáng)性對(duì)照（HEX通道）的Ct值為縱軸，繪制兩條標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，r2必須大于0.95。再以待測(cè)樣品的Ct值從分別從兩條標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上推算出對(duì)應(yīng)樣品RNA濃度的log值，再推算出其濃度。

16.                      對(duì)定性檢測(cè)，只判斷陽(yáng)性或陰性，則陰性對(duì)照FAM通道的Ct必須大于或等于40。陽(yáng)性對(duì)照FAM通道的熒光信號(hào)必須有對(duì)數(shù)增長(zhǎng)，有典型擴(kuò)增曲線(xiàn)，Ct值應(yīng)該小于或等于35。對(duì)待測(cè)樣品，如果其FAM通道的Ct大于或等于40則為甲型流感病毒H1亞型陰性，如果小于或等于35則為甲型流感病毒H1亞型陽(yáng)性。如果其HEX通道的Ct大于或等于40則為甲型流感病毒N1亞型陰性，如果小于或等于35則為甲型流感病毒N1亞型陽(yáng)性。如果在35-40之間，則重復(fù)一次。重復(fù)實(shí)驗(yàn)的Ct值如果大于或等于40則為陰性，如果小于40，則為陽(yáng)性。

關(guān)聯(lián)產(chǎn)品

甲型流感病毒H1N1亞型雙重探針?lè)╭RT-LAMP檢測(cè)及分型試劑盒