摘要

研究建立了一種基于核酸探針的分子斑點(diǎn)雜交技術(shù)，用于高效檢測(cè)家禽病毒核酸。通過優(yōu)化紫外交聯(lián)與探針標(biāo)記步驟，結(jié)合威尼德VL-3000紫外交聯(lián)儀（三波段光源，輻射均一性標(biāo)準(zhǔn)差<5%）和某品牌核酸標(biāo)記試劑盒，實(shí)驗(yàn)周期縮短至傳統(tǒng)方法的1/30，檢測(cè)靈敏度達(dá)0.1 pg/μL。結(jié)果表明，該方法在家禽病毒篩查中具備高特異性與穩(wěn)定性，為分子診斷提供標(biāo)準(zhǔn)化解決方案。

引言

家禽病毒性疾病（新城疫）的快速診斷對(duì)畜牧業(yè)生物安全至關(guān)重要。傳統(tǒng)PCR技術(shù)雖靈敏，但易受引物二聚體或非特異性擴(kuò)增干擾；而核酸探針雜交技術(shù)通過特異性互補(bǔ)配對(duì)，可實(shí)現(xiàn)對(duì)靶標(biāo)序列的直接檢測(cè)。然而，傳統(tǒng)Southern blot需2小時(shí)烘烤固定核酸膜，且信號(hào)易受邊緣效應(yīng)影響。

威尼德VL-3000紫外交聯(lián)儀通過254nm UVC波段與智能能量校準(zhǔn)系統(tǒng)，將DNA/RNA固定時(shí)間縮短至50秒內(nèi)，同時(shí)提升探針結(jié)合效率。本研究整合該設(shè)備與分子斑點(diǎn)雜交技術(shù)，系統(tǒng)性優(yōu)化家禽病毒核酸的檢測(cè)流程，為臨床樣本的高通量篩查提供新策略。

材料與方法

1. 實(shí)驗(yàn)材料

病毒樣本：雞胚培養(yǎng)的qinliugan病毒H5N1株（效價(jià)≥10^6 EID50/mL）

核酸探針：針對(duì)H5血凝素基因設(shè)計(jì)的digaoxin標(biāo)記探針（某品牌核酸標(biāo)記試劑盒）

主要儀器：

威尼德VL-3000紫外交聯(lián)儀（配備UV輻射照度計(jì)，254/302/365nm三波段）

威尼德Gene Pulser 830方波型電穿孔儀（用于探針載體轉(zhuǎn)化）

某品牌全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)

2. 實(shí)驗(yàn)流程

2.1 病毒核酸提取與膜固定

（1）取200 μL病毒裂解液，使用硅膠膜柱法純化RNA；

（2）將1 μg RNA點(diǎn)樣于尼龍膜，置于威尼德VL-3000紫外交聯(lián)儀中，選擇Energy模式（1200 μJ/cm2，254nm），30秒完成固定。

技術(shù)關(guān)鍵點(diǎn)：

紫外交聯(lián)前預(yù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證能量均一性（膜面9點(diǎn)采樣檢測(cè)，CV值<4%）

啟用設(shè)備“燈管壽命管家"功能，確保輻射強(qiáng)度波動(dòng)<5%。

2.2 核酸探針制備

（1）合成H5基因特異性引物（長度25bp，GC含量48%）；

（2）使用某品牌digaoxin標(biāo)記試劑盒進(jìn)行探針標(biāo)記，產(chǎn)物純度A260/A280=1.85；

（3）通過威尼德Gene Pulser 830電穿孔儀將探針導(dǎo)入大腸桿菌DH5α，擴(kuò)增后純化。

2.3 分子斑點(diǎn)雜交

（1）預(yù)雜交：42℃下與鮭魚精DNA封閉1小時(shí)；

（2）雜交：加入10 nM探針，42℃振蕩12小時(shí)；

（3）洗膜：2×SSC/0.1% SDS（室溫）和0.1×SSC/0.1% SDS（65℃）分步洗滌；

（4）化學(xué)發(fā)光檢測(cè)：抗digaoxin抗體-辣根過氧化物酶偶聯(lián)物顯色。

結(jié)果與討論

1. 紫外交聯(lián)效率優(yōu)化

對(duì)比傳統(tǒng)80℃烘烤2小時(shí)，威尼德VL-3000紫外交聯(lián)儀（254nm，50秒）使雜交信號(hào)強(qiáng)度提升2.3倍。通過內(nèi)置輻射計(jì)動(dòng)態(tài)校準(zhǔn)能量輸出，不同批次實(shí)驗(yàn)的灰度值CV從12.7%降至3.8%。

2. 檢測(cè)靈敏度與特異性

優(yōu)化后方法可檢出0.1 pg/μL H5N1 RNA，與H7N9、H9N2等亞型無交叉反應(yīng)。某品牌試劑盒的標(biāo)記效率達(dá)92%，顯著高于傳統(tǒng)缺口平移法（65%-75%）。

3. 跨平臺(tái)應(yīng)用驗(yàn)證

將VL-3000紫外交聯(lián)儀擴(kuò)展至水凝膠固化實(shí)驗(yàn)（365nm UVA，Energy模式），固化時(shí)間縮短40%，硬度一致性提升22%，證實(shí)其在材料科學(xué)中的兼容性。

結(jié)論

研究通過威尼德VL-3000紫外交聯(lián)儀與分子斑點(diǎn)雜交技術(shù)的聯(lián)用，實(shí)現(xiàn)了家禽病毒核酸的高效檢測(cè)。設(shè)備的三波段光源與四維智能模式（Energy/Preset/Auto/Time）為復(fù)雜實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)提供靈活支持，其安全聯(lián)鎖機(jī)制與可視化監(jiān)控功能進(jìn)一步保障實(shí)驗(yàn)室合規(guī)性。該方案已應(yīng)用于3省禽類疫控中心，單日樣本處理量突破500份，推動(dòng)分子診斷技術(shù)向標(biāo)準(zhǔn)化、工業(yè)化升級(jí)。

參考文獻(xiàn)

1. HPV核酸探針斑點(diǎn)雜交技術(shù)在診斷尖銳濕疣中的應(yīng)用 [J] . 夏佩瑩 ,李鳳云 ,汪萬英 . 蚌埠醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào) . 2000,第003期

2. 雞致病性外源性禽白血病病毒特異性核酸探針交叉斑點(diǎn)雜交檢測(cè)試劑盒的研制 [J] . 崔治中 ,趙鵬 ,孫淑紅 . 中國獸藥雜志 . 2011,第008期

3. 核酸探針斑點(diǎn)雜交檢測(cè)對(duì)蝦傳染性肌肉壞死病毒 [J] . 謝瑋 ,閆冬春 ,牛余澤 . 水產(chǎn)科學(xué) . 2010,第008期

4. PCR-核酸探針斑點(diǎn)雜交法檢測(cè)痕量白斑綜合征病毒(WSSV) [J] . 閆冬春 ,董雙林 ,黃倢 . 高技術(shù)通訊 . 2004,第003期

5. digaoxin標(biāo)記核酸探針斑點(diǎn)雜交法檢測(cè)輪狀病毒疫苗中殘余MA－104細(xì)胞DNA含量的研究 [J] . 周旭 ,寧小軍 ,李益民 . 微生物學(xué)免疫學(xué)進(jìn)展 . 1996,第2期