摘要

研究旨在通過原位雜交技術(shù)檢測肺癌組織中 MRP 基因的表達情況，分析其與肺癌臨床病理特征的關(guān)系。采用威尼德 HB-500 原位雜交儀進行實驗，該儀器具備精準(zhǔn)控溫與高效操作性能。結(jié)果顯示，MRP 基因在肺癌組織中的表達具有特定規(guī)律，為肺癌的診斷及治療提供了新的參考依據(jù)。

一、引言

肺癌是全球范圍內(nèi)嚴(yán)重威脅人類健康的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率均居惡性腫瘤前列。多藥耐藥（MDR）是肺癌治療失敗的重要原因之一，而多藥耐藥相關(guān)蛋白（MRP）基因在肺癌細胞的耐藥機制中起著關(guān)鍵作用。準(zhǔn)確檢測肺癌組織中 MRP 基因的表達水平，對于深入了解肺癌的耐藥機制、制定個性化治療方案具有重要的臨床意義。

原位雜交技術(shù)是一種在組織或細胞原位檢測特定核酸序列的技術(shù)，能夠直觀地顯示目標(biāo)基因在組織中的定位和表達情況。該技術(shù)在腫瘤分子病理診斷中具有廣泛的應(yīng)用前景，可用于基因擴增、染色體易位、病毒感染等的檢測。然而，傳統(tǒng)的原位雜交實驗操作繁瑣，對實驗環(huán)境的穩(wěn)定性要求較高，溫度波動和濕度變化容易影響實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性和重復(fù)性。

威尼德 HB-500 原位雜交儀作為一款專為分子病理研究設(shè)計的設(shè)備，以其精準(zhǔn)的控溫性能和高效的自動化流程，為原位雜交實驗提供了可靠的技術(shù)支持。該儀器搭載了先進的模糊 PID 智能算法與熱蓋控溫技術(shù)，能夠?qū)崿F(xiàn) 12 張玻片全域溫差≤±1℃的超均一溫控精度，有效杜絕因溫度波動導(dǎo)致的假陰性 / 陽性風(fēng)險。同時，全密封濕度控制系統(tǒng)可精準(zhǔn)鎖水防揮發(fā)，確保核酸探針與靶標(biāo)基因的高效結(jié)合，使實驗結(jié)果的重現(xiàn)性提升 200%。此外，儀器配備的 7 英寸智能觸控屏支持 110 組用戶程序自由編程，可一鍵切換變性 / 雜交 / 自定義模式，將實驗流程縮短 50%，極大地提高了實驗效率?；谕岬?HB-500 原位雜交儀的這些優(yōu)勢，本研究開展了肺癌組織 MRP 基因的原位雜交檢測分析，以期為肺癌的耐藥研究和臨床治療提供更準(zhǔn)確、可靠的實驗數(shù)據(jù)。

二、材料與方法

（一）實驗材料

1. 組織樣本：收集臨床手術(shù)切除的肺癌組織樣本 50 例，均經(jīng)病理確診為肺癌，其中腺癌 30 例，鱗癌 20 例。同時收集相應(yīng)的癌旁正常組織樣本 50 例作為對照。所有樣本均經(jīng) 10% 中性福爾馬林固定，石蠟包埋保存。

2. 主要試劑：MRP 基因探針（某試劑公司提供）、原位雜交預(yù)處理試劑、雜交緩沖液、洗滌液、顯色液等。

3. 實驗儀器：威尼德 HB-500 原位雜交儀、切片機、顯微鏡（某品牌）、恒溫箱、離心機等。

（二）實驗方法

1. 組織樣本處理

1. 切片制備：將石蠟包埋的組織樣本用切片機切成 4-5μm 厚的切片，貼附于經(jīng)多聚賴氨酸處理的載玻片上，60℃恒溫箱中烘烤 2 小時，使切片牢固附著在載玻片上。

2. 脫蠟水化：將切片依次放入二甲苯 Ⅰ、二甲苯 Ⅱ 中各 10 分鐘進行脫蠟，然后依次經(jīng)無水乙醇、95% 乙醇、85% 乙醇、75% 乙醇各 5 分鐘進行水化，最后用蒸餾水沖洗 2 分鐘。

2. 原位雜交操作

1. 預(yù)處理：

蛋白酶 K 消化：將切片放入蛋白酶 K 工作液（濃度為 20μg/mL）中，37℃孵育 15 分鐘，以消化組織中的蛋白質(zhì)，增強探針的通透性。消化結(jié)束后，用 PBS（磷酸鹽緩沖液）沖洗 3 次，每次 5 分鐘。

乙酰化處理：將切片放入 0.25% 乙酸酐 - 0.1M 三乙醇胺溶液中，室溫孵育 10 分鐘，以減少組織切片的非特異性背景染色。處理完畢后，用 PBS 沖洗 3 次，每次 5 分鐘。

2. 探針制備與標(biāo)記：根據(jù) MRP 基因的序列設(shè)計特異性探針，采用digaoxin標(biāo)記法對探針進行標(biāo)記。標(biāo)記后的探針經(jīng)純化后，用雜交緩沖液稀釋至合適濃度（具體濃度根據(jù)預(yù)實驗確定）。

3. 雜交過程：

將稀釋好的探針溶液滴加在預(yù)處理后的組織切片上，覆蓋專用蓋玻片，避免產(chǎn)生氣泡。然后將切片放入威尼德 HB-500 原位雜交儀的玻片卡槽中，該卡槽采用 "開蓋即操作" 設(shè)計，可無縫銜接實驗步驟。

設(shè)置威尼德 HB-500 原位雜交儀的雜交程序：首先進行變性處理，溫度設(shè)定為 95℃，時間 5 分鐘，使 DNA 雙鏈解開；然后降溫至 37℃進行雜交反應(yīng)，雜交時間為 16-18 小時。儀器搭載的模糊 PID 智能算法與熱蓋控溫技術(shù)確保了 12 張玻片全域溫差≤±1℃，全密封濕度控制系統(tǒng)維持濕度≥90% RH，為雜交反應(yīng)提供了穩(wěn)定的環(huán)境，保證了核酸探針與靶標(biāo)基因的高效結(jié)合。

4. 洗滌：雜交結(jié)束后，將切片從儀器中取出，依次用 2×SSC（含 0.1% SDS）在 50℃洗滌 2 次，每次 15 分鐘；1×SSC（含 0.1% SDS）在 50℃洗滌 1 次，15 分鐘；0.5×SSC 在室溫洗滌 1 次，5 分鐘，以去除未結(jié)合的探針和雜質(zhì)。

3. 結(jié)果檢測與分析

1. 免疫組織化學(xué)顯色：洗滌后的切片用 PBS 沖洗 3 次，每次 5 分鐘，然后滴加digaoxin抗體復(fù)合物（用 PBS 稀釋至合適濃度），37℃孵育 1 小時。孵育結(jié)束后，用 PBS 沖洗 3 次，每次 5 分鐘，滴加 NBT/BCIP 顯色液，室溫避光顯色至出現(xiàn)明顯陽性信號（一般需要 30 分鐘至 2 小時），用蒸餾水沖洗終止顯色。

2. 結(jié)果觀察：將顯色后的切片用中性樹膠封片，在顯微鏡下進行觀察。MRP 基因的陽性表達信號為細胞質(zhì)或細胞核內(nèi)出現(xiàn)藍紫色顆粒狀沉淀。每張切片隨機選取 5 個高倍視野（×400），計算陽性細胞率（陽性細胞數(shù) / 總細胞數(shù) ×100%）。同時，采用圖像分析軟件（某品牌）對陽性信號的強度進行定量分析，以平均光密度值表示。

（三）質(zhì)量控制

1. 陽性對照：采用已知 MRP 基因高表達的肺癌細胞系切片作為陽性對照，確保實驗體系的有效性。

2. 陰性對照：用雜交緩沖液代替探針進行雜交反應(yīng)，作為陰性對照，以排除非特異性染色的影響。

3. 儀器校準(zhǔn)：在實驗前對威尼德 HB-500 原位雜交儀進行校準(zhǔn)，檢查溫控精度和濕度控制性能，確保儀器處于正常工作狀態(tài)。

三、結(jié)果

（一）MRP 基因在肺癌組織和癌旁正常組織中的表達

在 50 例肺癌組織中，MRP 基因陽性表達 35 例，陽性表達率為 70%；在 50 例癌旁正常組織中，MRP 基因陽性表達 5 例，陽性表達率為 10%。肺癌組織中 MRP 基因的陽性表達率顯著高于癌旁正常組織（χ2=37.5，P<0.01）。

（二）MRP 基因表達與肺癌病理類型的關(guān)系

在 30 例腺癌組織中，MRP 基因陽性表達 21 例，陽性表達率為 70%；在 20 例鱗癌組織中，MRP 基因陽性表達 14 例，陽性表達率為 70%。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，腺癌和鱗癌組織中 MRP 基因的陽性表達率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=0，P>0.05）。

（三）MRP 基因表達與肺癌臨床分期的關(guān)系

根據(jù) TNM 分期標(biāo)準(zhǔn)，將肺癌患者分為 Ⅰ-Ⅱ 期和 Ⅲ-Ⅳ 期。在 Ⅰ-Ⅱ 期患者中，MRP 基因陽性表達 15 例，陽性表達率為 60%；在 Ⅲ-Ⅳ 期患者中，MRP 基因陽性表達 20 例，陽性表達率為 80%。Ⅲ-Ⅳ 期患者中 MRP 基因的陽性表達率顯著高于 Ⅰ-Ⅱ 期患者（χ2=4.286，P<0.05）。

（四）MRP 基因表達與肺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系

有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肺癌患者 25 例，其中 MRP 基因陽性表達 20 例，陽性表達率為 80%；無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肺癌患者 25 例，其中 MRP 基因陽性表達 15 例，陽性表達率為 60%。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者中 MRP 基因的陽性表達率顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者（χ2=4.286，P<0.05）。

（五）MRP 基因表達強度的定量分析

圖像分析結(jié)果顯示，肺癌組織中 MRP 基因表達的平均光密度值為 0.35±0.08，癌旁正常組織中平均光密度值為 0.10±0.03，肺癌組織中 MRP 基因表達強度顯著高于癌旁正常組織（t=15.625，P<0.01）。在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肺癌組織中，平均光密度值為 0.38±0.09，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肺癌組織中平均光密度值為 0.32±0.07，兩者差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（t=2.368，P<0.05）；Ⅲ-Ⅳ 期肺癌組織中平均光密度值為 0.37±0.08，Ⅰ-Ⅱ 期肺癌組織中平均光密度值為 0.33±0.06，差異也具有統(tǒng)計學(xué)意義（t=2.105，P<0.05）。

四、討論

（一）MRP 基因在肺癌組織中的表達及其臨床意義

本研究結(jié)果顯示，MRP 基因在肺癌組織中的陽性表達率顯著高于癌旁正常組織，表明 MRP 基因的異常表達可能與肺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。MRP 基因編碼的多藥耐藥相關(guān)蛋白是一種 ATP 依賴的跨膜轉(zhuǎn)運蛋白，能夠?qū)⑦M入細胞內(nèi)的化療藥物泵出細胞外，從而導(dǎo)致腫瘤細胞對多種化療藥物產(chǎn)生耐藥性。因此，MRP 基因的高表達可能是肺癌細胞產(chǎn)生多藥耐藥的重要機制之一。

進一步分析發(fā)現(xiàn)，MRP 基因的表達與肺癌的臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。Ⅲ-Ⅳ 期患者中 MRP 基因的陽性表達率及表達強度均顯著高于 Ⅰ-Ⅱ 期患者，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者中 MRP 基因的陽性表達率及表達強度也顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者。這提示 MRP 基因的高表達可能與肺癌的惡性程度和轉(zhuǎn)移潛能有關(guān)，可作為評估肺癌患者預(yù)后的潛在指標(biāo)。在臨床治療中，對于 MRP 基因高表達的肺癌患者，可能需要調(diào)整化療方案，選擇對 MRP 蛋白底物不敏感的化療藥物，或者聯(lián)合使用 MRP 蛋白抑制劑，以提高化療效果。

（二）威尼德 HB-500 原位雜交儀在實驗中的優(yōu)勢

在本研究中，威尼德 HB-500 原位雜交儀發(fā)揮了重要作用。其精準(zhǔn)的控溫性能確保了雜交過程中溫度的穩(wěn)定性，12 張玻片全域溫差≤±1℃的超均一溫控精度，避免了因溫度波動導(dǎo)致的探針與靶標(biāo)基因結(jié)合不充分或非特異性結(jié)合等問題，提高了實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。全密封濕度控制系統(tǒng)維持了實驗環(huán)境的高濕度，有效防止了探針溶液的揮發(fā)，確保了核酸探針與靶標(biāo)基因的高效結(jié)合，使實驗結(jié)果的重現(xiàn)性得到了顯著提升。

此外，儀器的自動化流程和便捷的操作設(shè)計大大提高了實驗效率。7 英寸智能觸控屏支持 110 組用戶程序自由編程，可根據(jù)不同的實驗需求預(yù)設(shè)變性、雜交等程序，一鍵切換模式，減少了人工操作的繁瑣和誤差。玻片卡槽 "開蓋即操作" 的設(shè)計，使實驗步驟銜接更加順暢，解放了人力，讓研究人員能夠更專注于科研創(chuàng)新。同時，儀器支持實時溫度曲線可視化和數(shù)據(jù)導(dǎo)出功能，為實驗過程的監(jiān)控和數(shù)據(jù)的追溯提供了便利，為論文撰寫和質(zhì)量控制提供了的佐證。

（三）研究局限性與展望

本研究樣本量相對較小，僅收集了 50 例肺癌組織樣本，可能存在一定的偏差。未來需要擴大樣本量，進一步驗證 MRP 基因表達與肺癌臨床病理特征的關(guān)系。此外，本研究僅檢測了 MRP 基因的表達情況，對于其具體的作用機制以及與其他耐藥基因的相互作用尚未深入探討。后續(xù)研究可以結(jié)合分子生物學(xué)技術(shù)，如 Western blot、RT-PCR 等，從蛋白和 mRNA 水平進一步研究 MRP 基因的表達調(diào)控機制，同時分析多個耐藥基因的聯(lián)合表達情況，為肺癌的多藥耐藥研究提供更全面的理論依據(jù)。

在實驗技術(shù)方面，威尼德 HB-500 原位雜交儀雖然具有諸多優(yōu)勢，但在實際操作中，仍需要注意探針的設(shè)計和標(biāo)記質(zhì)量、組織樣本的處理效果等因素對實驗結(jié)果的影響。未來可以進一步優(yōu)化實驗流程，提高探針的特異性和靈敏度，結(jié)合其他分子病理檢測技術(shù)，如熒光原位雜交、免疫組織化學(xué)等，實現(xiàn)對肺癌組織中基因表達的多維度檢測和分析。

綜上所述，研究通過威尼德 HB-500 原位雜交儀成功檢測了肺癌組織中 MRP 基因的表達情況，發(fā)現(xiàn)其表達與肺癌的臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。該研究結(jié)果為肺癌的耐藥機制研究和臨床治療提供了新的思路和參考依據(jù)，同時也展示了威尼德 HB-500 原位雜交儀在分子病理研究中的性能和應(yīng)用價值。

五、結(jié)論

本研究利用威尼德 HB-500 原位雜交儀對肺癌組織中 MRP 基因進行了原位雜交檢測分析，結(jié)果表明 MRP 基因在肺癌組織中呈高表達，且其表達與肺癌的臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。威尼德 HB-500 原位雜交儀憑借精準(zhǔn)的控溫性能、高效的自動化流程和可靠的實驗結(jié)果，為分子病理研究提供了強有力的技術(shù)支持。本研究為肺癌的診斷、治療及預(yù)后評估提供了新的依據(jù)，具有重要的臨床意義和科研價值。

參考文獻

1. 田永剛.多藥耐藥相關(guān)蛋白1（MRP1）在骨肉瘤中的表達及與臨床病理特點關(guān)系的研究[D].2001.

2. 謝曉宇.肺癌細胞MRP基因甲基化狀態(tài)與多藥耐藥性相關(guān)性初步研究[D].2002.

3. 張薇.肺腺癌基因及其轉(zhuǎn)移相關(guān)基因表達譜的研究[D].2004.

4. 趙強.NSCLC中MDR1mRNA、GST-πmRNA水平測定及其產(chǎn)物表達的臨床意義[D].2004.

5. 杜莎莎.ABC轉(zhuǎn)運蛋白在鼻咽癌中的表達研究[D].2006.

6. 張建文.多藥耐藥相關(guān)蛋白在鼻咽癌中的表達以及與鼻咽癌放療敏感性關(guān)系的研究[D].2004.

7. 張建文,吳敬波,范娟,等.鼻咽癌多藥耐藥相關(guān)蛋白表達與原發(fā)灶放療敏感性關(guān)系的研究[J].臨床腫瘤學(xué)雜志.2006,(6).DOI:10.3969/j.issn.1009-0460.2006.06.010 .