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細胞電轉(zhuǎn)染的步驟

閱讀:3580        發(fā)布時間:2018/12/3
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轉(zhuǎn)染是真核細胞主動或被動導入外源DNA片段而獲得新的表型的過程。電擊完成后用恒溫培養(yǎng)箱進行測試也是很關(guān)鍵的步驟,下面給大家介紹下電轉(zhuǎn)染詳細步驟。

1.清洗電轉(zhuǎn)杯,將電轉(zhuǎn)杯置于75%酒精中浸泡2小時,然后在紫外燈下照射后即可使用。

2.電穿孔前一天,以合適密度傳代細胞,使細胞在轉(zhuǎn)染前出于對數(shù)生長期。對于原代培養(yǎng)細胞,一般培養(yǎng)2-3天后,細胞單層融合度可以達到70-80%,即可開始試驗。

3.PBS洗細胞2次后,胰酶消化細胞2min,待細胞變圓后,用*培養(yǎng)基終止消化。

4.輕輕吹下細胞成單細胞懸液后,1200rpm室溫離心5min。

5.*棄去上清,根據(jù)細胞數(shù)量,加入適量的電轉(zhuǎn)緩沖液重懸細胞(一般為0.5-0.6ml左右),并上下吹打均勻。

6.加入適量相應(yīng)濃度的待轉(zhuǎn)染核酸至相應(yīng)的終濃度(質(zhì)粒為20ug/ml,SiRNA的終濃度為100nM),上下吹打均勻。若以0.5ml計算,所需質(zhì)粒為0.5×20=10ug。

7.將含有相應(yīng)濃度核酸的細胞懸液轉(zhuǎn)移入相應(yīng)規(guī)格的電轉(zhuǎn)杯中,按照預(yù)定條件設(shè)置參數(shù),進行電擊操作。

8.電擊完成后,將電轉(zhuǎn)杯置于恒溫培養(yǎng)箱中8-12min,以使核酸充分進入細胞。

9.將電擊杯從恒溫培養(yǎng)箱中取出,接種細胞懸液于預(yù)熱的培養(yǎng)基中,上下吹打均勻后,置于培養(yǎng)箱中正常培養(yǎng)。

10.正常培養(yǎng)4h,待細胞貼壁后,給細胞換新鮮的*培養(yǎng)基,以去除上層的死細胞。

11.培養(yǎng)24h后,即可進行細胞轉(zhuǎn)染效率的檢測或是進行細胞的實驗處理。

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