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細胞電轉(zhuǎn)染的步驟
轉(zhuǎn)染是真核細胞主動或被動導入外源DNA片段而獲得新的表型的過程。電擊完成后用恒溫培養(yǎng)箱進行測試也是很關(guān)鍵的步驟，下面給大家介紹下電轉(zhuǎn)染詳細步驟。
1.清洗電轉(zhuǎn)杯，將電轉(zhuǎn)杯置于75%酒精中浸泡2小時，然后在紫外燈下照射后即可使用。
2.電穿孔前一天，以合適密度傳代細胞，使細胞在轉(zhuǎn)染前出于對數(shù)生長期。對于原代培養(yǎng)細胞，一般培養(yǎng)2-3天后，細胞單層融合度可以達到70-80%，即可開始試驗。
3.PBS洗細胞2次后，胰酶消化細胞2min，待細胞變圓后，用*培養(yǎng)基終止消化。
4.輕輕吹下細胞成單細胞懸液后，1200rpm室溫離心5min。
5.*棄去上清，根據(jù)細胞數(shù)量，加入適量的電轉(zhuǎn)緩沖液重懸細胞（一般為0.5-0.6ml左右），并上下吹打均勻。
6.加入適量相應(yīng)濃度的待轉(zhuǎn)染核酸至相應(yīng)的終濃度（質(zhì)粒為20ug/ml，SiRNA的終濃度為100nM），上下吹打均勻。若以0.5ml計算，所需質(zhì)粒為0.5×20=10ug。
7.將含有相應(yīng)濃度核酸的細胞懸液轉(zhuǎn)移入相應(yīng)規(guī)格的電轉(zhuǎn)杯中，按照預(yù)定條件設(shè)置參數(shù)，進行電擊操作。
8.電擊完成后，將電轉(zhuǎn)杯置于恒溫培養(yǎng)箱中8-12min，以使核酸充分進入細胞。
9.將電擊杯從恒溫培養(yǎng)箱中取出，接種細胞懸液于預(yù)熱的培養(yǎng)基中，上下吹打均勻后，置于培養(yǎng)箱中正常培養(yǎng)。
10.正常培養(yǎng)4h，待細胞貼壁后，給細胞換新鮮的*培養(yǎng)基，以去除上層的死細胞。
11.培養(yǎng)24h后,即可進行細胞轉(zhuǎn)染效率的檢測或是進行細胞的實驗處理。