一、試劑盒的組成與工作原理

試劑盒的組成

活/死細胞雙染色試劑盒主要包含兩種關(guān)鍵熒光染料：用于標記活細胞的綠色熒光染料和用于標記死細胞的紅色熒光染料。這兩種染料具有不同的化學特性和作用機制，能夠分別與活細胞和死細胞中的特定成分結(jié)合，從而實現(xiàn)對細胞生死狀態(tài)的區(qū)分。

工作原理

綠色熒光染料（如 Calcein-AM）能夠自由穿透活細胞的細胞膜，并在細胞內(nèi)被酯酶轉(zhuǎn)化為具有熒光的 Calcein，從而發(fā)出明亮的綠色熒光。這一特性使得綠色熒光染料成為標記活細胞的理想選擇?；罴毎哪ね暾粤己?，能夠有效地攝取并保留綠色熒光染料，而死細胞由于細胞膜的破損，無法有效攝取或保留該染料。

紅色熒光染料（如 PI）則主要用于標記死細胞。PI 是一種核酸染料，能夠與細胞內(nèi)的 DNA 結(jié)合并發(fā)出紅色熒光。在活細胞中，細胞膜的完整性阻止 PI 進入細胞內(nèi)；而在死細胞中，細胞膜的破損使得 PI 能夠自由進入并與 DNA 結(jié)合，從而發(fā)出紅色熒光。

二、操作使用方法

染色前準備

1. 細胞培養(yǎng)：根據(jù)實驗需求，將細胞培養(yǎng)至適宜的密度。對于貼壁細胞，可使用胰蛋白酶消化并收集細胞；對于懸浮細胞，直接收集即可。用PBS 洗滌細胞兩次，去除培養(yǎng)基和其他雜質(zhì)。

2. 細胞計數(shù)與調(diào)整濃度：對收集到的細胞進行計數(shù)，并用適當?shù)木彌_液調(diào)整細胞濃度，一般建議的細胞濃度范圍為

   $1 \times 10^5 - 1 \times 10^6 \, \text{cells/mL}$

   ，以確保在后續(xù)的染色和檢測過程中能夠獲得理想的信號強度和細胞分布。

染色過程

1. 取適量細胞懸液：取適量的細胞懸液（通常為 100 μL），加入到新的離心管或培養(yǎng)皿中。

2. 加入染色試劑：按照試劑盒說明書的要求，分別加入適量的綠色熒光染料和紅色熒光染料。一般情況下，每 100 μL 細胞懸液中需加入數(shù)微升的每種染料，具體用量應根據(jù)試劑盒的推薦進行調(diào)整。

3. 輕輕混勻：輕輕吹打或漩渦混勻細胞懸液，確保染料均勻分布并充分接觸細胞。這一步驟對于保證染色的均勻性和準確性至關(guān)重要。

4. 避光孵育：將染色后的細胞懸液置于適當?shù)臏囟龋ㄈ?37℃）下避光孵育一段時間，通常為 15 - 30 分鐘。避光孵育有助于防止染料的光漂白，確保熒光信號的穩(wěn)定和清晰。

染色后處理

1. 去除未結(jié)合的染料：用預冷的 PBS 或其他適當?shù)木彌_液洗滌細胞一次，以去除未結(jié)合的染料。離心速度為 300×g，離心時間為 5 分鐘。用適量的緩沖液重新懸浮細胞，以減少背景熒光并提高檢測的準確性。

2. 分析檢測：將染色后的細胞懸液轉(zhuǎn)移到流式細胞儀檢測管或熒光顯微鏡載玻片上，立即進行檢測。在流式細胞儀中，綠色熒光的激發(fā)波長一般為 488 - 500 nm，發(fā)射波長為 510 - 530 nm；紅色熒光的激發(fā)波長一般為 490 - 540 nm，發(fā)射波長為 600 - 630 nm。

三、質(zhì)量控制與注意事項

質(zhì)量控制

活/死細胞雙染色試劑盒應保存在 4℃左右的低溫環(huán)境中，避免光照直射和溫度波動過大。在保存過程中，注意密封保存，防止試劑揮發(fā)或吸收水分。試劑盒在有效期內(nèi)具有良好的穩(wěn)定性，每一批次都經(jīng)過嚴格的質(zhì)量檢測，確保其性能符合要求。

注意事項

在實驗過程中，需嚴格遵循無菌操作規(guī)范，避免細胞受到污染。使用的試劑、培養(yǎng)容器和操作工具都應經(jīng)過嚴格的滅菌處理。實驗操作應在超凈工作臺中進行，以降低污染風險。

染色時間應根據(jù)細胞類型和實驗需求進行優(yōu)化。過短的染色時間可能導致染色不充分，影響檢測結(jié)果；過長的染色時間則可能導致非特異性染色，增加背景信號。建議在正式實驗前進行小規(guī)模的預實驗，以確定最佳的染色條件。

這兩種熒光染料對光敏感，操作過程中應盡量減少樣本的光照時間，以防止熒光淬滅。在染色和檢測過程中，應使用適當?shù)谋芄獯胧?，如使用避光罩或在暗室中操作。細胞狀態(tài)監(jiān)測：實驗全程觀察細胞狀態(tài)，確保良好生理狀態(tài)，異常時及時調(diào)整條件。