Mouse VEGF ELISA Kit 技術(shù)參數(shù)拆解：把 165 與 120 兩個(gè)數(shù)字讀透

VEGF-A 的氨基酸長(zhǎng)度從 121 到 206 不等，市面上所有 Mouse VEGF ELISA Kit 幾乎都以 VEGF165 為校準(zhǔn)骨架。同一批血清樣本，用識(shí)別 165 的盒子測(cè)出 400 pg/mL，換 120  kit 可能只剩 120 pg/mL。把技術(shù)參數(shù)拆成 7 個(gè)維度，每個(gè)維度給出實(shí)測(cè)邊界值，以后拿到 COA 直接對(duì)號(hào)入座，10 min 就能判斷這支盒子能否匹配你的樣本類型。

1. 捕獲抗體表位：114–126 區(qū)段是黃金坐標(biāo)

晶體結(jié)構(gòu)顯示 VEGF165 的受體結(jié)合域在 114–126 位氨基酸。

驗(yàn)證方法：

• 說明書“Immunogen"若寫“recombinant mouse VEGF164 (aa 114–126)"或“VEGF-A (K123-R140)"，說明表位覆蓋受體結(jié)合域，檢測(cè)的是生物活性形式。

• 出現(xiàn)“VEGF120 full length"或“VEGF188 N-term"直接跳過，腫瘤組織里 120 亞型高，結(jié)果會(huì)虛高 30 %–50 %。

2. 標(biāo)準(zhǔn)品分子量：39 kDa 還是 42 kDa 決定換算系數(shù)

VEGF165 糖基化后 42 kDa，非糖基化 39 kDa。

關(guān)鍵參數(shù)：

• COA 里“Molecular mass of calibrator"寫 39 kDa，代表 E.coli 表達(dá)，無翻譯后修飾；寫 42 kDa 則是 CHO 真核表達(dá)，更接近血清天然形態(tài)。

• 做腫瘤勻漿選 42 kDa，做細(xì)胞上清或基因敲除驗(yàn)證選 39 kDa，批間差更小。

3. 檢測(cè)限與功能靈敏度：0.9 pg/mL 只是理論值

廠商把 2 倍空白標(biāo)準(zhǔn)差當(dāng)檢測(cè)限（LOD），實(shí)際樣本里基質(zhì)背景能把 LOD 抬高 3 倍。

實(shí)測(cè)步驟：

• 取 6 只 C57BL/6 小鼠基礎(chǔ)血清，各 100 µL，加 3 個(gè)濃度標(biāo)準(zhǔn)品（2、5、10 pg/mL）做回收?；厥章?80–120 % 的低濃度才是“功能靈敏度"。

• 功能靈敏度 ≤5 pg/mL 的盒子才夠測(cè)正常小鼠血漿，高于 10 pg/mL 只能測(cè)腫瘤或缺血模型。

4.  Hook 效應(yīng)上限：30 000 pg/mL 是紅線

VEGF 過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 48 h 后，細(xì)胞上清濃度能沖到 25 000 pg/mL。

參數(shù)判讀：

• 說明書“Upper limit of quantification (Hook)"≥30 000 pg/mL，代表抗體親和足夠，高劑量不會(huì)假低。

• 若只寫 10 000 pg/mL，腫瘤裂解液必須預(yù)稀釋 1:5，否則落在 Hook 區(qū)，結(jié)果比真值低 40 %。

5. 亞型交叉矩陣：120、164、188 各占多少？

VEGF-A 基因外顯子 6 和 7 剪接差異產(chǎn)生 120、164、188 三個(gè)主要亞型。

交叉率表格：

6. 回收與稀釋線性：1:2 和 1:8 都要過關(guān)

小鼠血清含脂蛋白顆粒，容易把 VEGF 包埋。

合格線：

• 加入 100、1000、4000 pg/mL 標(biāo)準(zhǔn)品，回收率 90–110 %。

• 1:2、1:4、1:8 三個(gè)稀釋比，線性相關(guān)系數(shù) r≥0.99，斜率 0.9–1.1。

滿足兩項(xiàng)指標(biāo)，說明稀釋液里已含解離劑，無需額外加 0.1 % Tween-20。

7. 批間差與加速穩(wěn)定性：37 °C 7 天偏差 <8 %

VEGF 標(biāo)準(zhǔn)品含肝素穩(wěn)定劑，但糖基化位點(diǎn)仍易氧化。

質(zhì)控技巧：

• COA 附“Accelerated stability test"：37 °C 7 天，標(biāo)準(zhǔn)曲線 ED50 偏差 <8 %。

• 無此項(xiàng)數(shù)據(jù)的批次，到貨立即分裝 –20 °C，避免反復(fù)凍融導(dǎo)致標(biāo)準(zhǔn)品降 15 %。

8. 技術(shù)參數(shù)速查表（貼實(shí)驗(yàn)臺(tái)）

把 7 項(xiàng)指標(biāo)全部打鉤再下單，基本能把腫瘤勻漿、缺血視網(wǎng)膜、細(xì)胞上清三種樣本一次性測(cè)準(zhǔn)。