細(xì)胞分析實(shí)驗(yàn)室里，CCL1 常被當(dāng)作“趨化因子"來討論；真正讓儀器工程師熬夜的，卻是它背后那臺單細(xì)胞測序儀。把機(jī)器跑通、數(shù)據(jù)跑準(zhǔn)，比任何綜述都值錢。
溫度 22 ± 1 °C，濕度 45–55 %RH，記錄到 LIMS
激光器冷卻水壓力 ≥ 0.35 MPa，否則下一步直接報(bào)錯 0x0A17
鞘液桶剩余量 ≥ 20 %，桶壁無氣泡；氣泡=堵孔=數(shù)據(jù)丟 30 %
負(fù)壓表讀數(shù) ?0.55 bar，偏差 0.02 就重新校準(zhǔn)，別等跑樣一半再調(diào)
把 10× Genomics Chip G 從 4 °C 取出，平放 5 min 去冷凝水
按住兩側(cè)卡扣，水平推入進(jìn)樣槽，聽到“咔嗒"才算鎖死
在軟件里點(diǎn)“Load"，觀察攝像頭畫面：通道內(nèi)液面呈一條直線，無分叉
一旦出現(xiàn)“波浪紋"，立即退出，換新芯片；強(qiáng)行繼續(xù)會讓 GEM 生成率掉到 60 % 以下
目標(biāo)捕獲 6 000 細(xì)胞，按 60 % 回收率倒推，上樣 10 000 細(xì)胞
用 AO/PI 熒光計(jì)數(shù)，活率 ≥ 85 %；死細(xì)胞多→游離 RNA 多→背景噪音高
細(xì)胞直徑 ＞ 30 μm 時(shí)，先用 40 μm 濾網(wǎng)過濾，防止堵塞微閥
懸液濃度調(diào)到 700–1 200 細(xì)胞/μL，體積 40 μL；濃度過低，GEM 生成不穩(wěn)，數(shù)據(jù)稀疏
| 指標(biāo) | 正常范圍 | 異常處理 |
|---|---|---|
| 綠燈“GEM Gen" | 12 000–14 000 /min | ＜10 k→檢查油相是否過期 |
| 黃燈“Cell Susp" | 變異系數(shù) ＜5 % | ＞8 %→重混細(xì)胞懸液 |
| 紅燈“Pressure" | ?0.52–?0.58 bar | 持續(xù)報(bào)警→停機(jī)，換泵膜 |
| 散點(diǎn)圖“Cell vs Bead" | 斜率 45° 直線 | 分叉→油水比例錯 |
| 曲線“Barcodes/Cell" | 峰值 4 000–7 000 | 雙峰→多細(xì)胞包裹，稀釋再上 |
立即用 0.5 % NaOCl 沖洗 10 min，分解殘留 PEG
再用 DI 水 15 min，保證電導(dǎo)率回到 1 μS/cm
卸下芯片，用無塵布蘸 70 % 乙醇單向擦拭表面，禁止來回擦
每周做 1 次 10 % Contrad 70 浸泡，過夜，去蛋白
關(guān)機(jī)前，把泵速降到 1 μL/min，讓管路充滿 0.02 % NaN? 防腐
用 CellRanger 7.2 對齊，參考基因組加 CCL1 轉(zhuǎn)錄本補(bǔ)丁，避免漏讀
設(shè)定 --expect-cells=6000，強(qiáng)制軟件按此范圍回收，減少雙細(xì)胞污染
輸出 filtered_feature_bc_matrix 直接扔進(jìn) Seurat v5，SCTransform 一鍵歸一化，節(jié)省 40 % 下行分析時(shí)間
| 現(xiàn)象 | 根因 | 現(xiàn)場解決 |
|---|---|---|
| 芯片氣泡反復(fù) | 油相分裝桶漏氣 | 換膠塞，重新抽真空 |
| 測序儀報(bào)錯 0x0B04 | 激光功率掉 10 % | 調(diào)電流，或預(yù)約 2 天更換激光頭 |
| 細(xì)胞捕獲率驟降 | 水相含 EDTA>0.5 mM | 換 PBS，重新計(jì)數(shù)上樣 |
| 下游線粒體基因>20 % | 細(xì)胞活性差 | 重新制備樣本，無法補(bǔ)救 |
每日：擦外殼，倒廢液，記錄壓力值
每周：做滿漂白-水-乙醇三部曲，拍照上傳云端
每月：拆下微閥板，顯微鏡檢劃痕，＞50 μm 裂紋就下單備件
每季度：激光功率計(jì)實(shí)測，偏差 5 % 以內(nèi)寫進(jìn)報(bào)告，超了就預(yù)約原廠校準(zhǔn)
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