PIGF 操作使用：把 50 ng/mL 標(biāo)準(zhǔn)品拆成 8 個(gè)可復(fù)現(xiàn)動(dòng)作

1. 溶解 30 s 漩渦：別讓粉末壁粘損失 8%

凍干 PIGF 呈薄膜狀貼壁，直接加 1 mL 無(wú)菌水，漩渦 30 s，回收率 98%；靜置 5 min 再顛倒混勻，可消除肉眼不可見(jiàn)的蛋白聚集體。跳過(guò)二次混勻步驟，SEC-HPLC 多出一個(gè) 12% 聚合峰，后續(xù)細(xì)胞實(shí)驗(yàn) EC50 向右漂移 1.6 倍。

2. 分裝 50 μL 管：鋁箔封口擋住 320 nm 光降解

液體 PIGF 4 °C 放置 72 h 活性掉 20%。預(yù)先把 1 mL 母液按 50 μL/管分裝，鋁箔避光，?80 °C 速凍，6 個(gè)月內(nèi)活性平臺(tái)維持 95%。透明管直射日光 2 h，活性損失 35%，等于直接報(bào)廢半管。

3. 稀釋梯度：用 0.1% HSA 替代 PBS，低吸附同時(shí)穩(wěn)態(tài)

塑料吸頭對(duì) PIGF 吸附率 12%，稀釋液里補(bǔ) 0.1% 重組人血清白蛋白，可把回收率拉到 99%。做血管生成實(shí)驗(yàn)，梯度 0–200 ng/mL，每步 2 倍稀釋?zhuān)珻V 控制在 5% 以?xún)?nèi)；去掉 HSA，低濃度點(diǎn)信號(hào)直接被管壁吃掉，曲線出現(xiàn)“斷尾"。

4. 內(nèi)皮鋪板：4 × 10? cells/孔，提前 2 h 貼壁

HUVEC 第 4 代以?xún)?nèi)，4 × 10? cells/孔（96 孔板）2 h 貼壁率 90%，再補(bǔ) PIGF 刺激，24 h 管腔分支數(shù)最清晰。細(xì)胞密度提到 6 × 10?，細(xì)胞間相互抑制，分支數(shù)反而下降 18%；低于 3 × 10?，孔壁裸露區(qū)域多，圖像分析軟件把背景算成管長(zhǎng)，數(shù)據(jù)虛高。

5. 刺激時(shí)序：16 h 節(jié)點(diǎn)拍照片，避開(kāi)凋亡窗口

PIGF 50 ng/mL 刺激 8 h 可見(jiàn)初步網(wǎng)格，16 h 管腔完整且凋亡率 <5%，拖到 24 h 細(xì)胞開(kāi)始回縮，管腔斷裂，軟件讀數(shù)出現(xiàn)假陰性。固定用 4% PFA 室溫 15 min，PBS 洗 3 次，再存放 48 h 內(nèi)拍照，分支點(diǎn)變異系數(shù) <6%。

6. 抗體阻斷：anti-Flt-1 10 μg/mL 做陽(yáng)性對(duì)照

驗(yàn)證特異性時(shí)，提前 30 min 加 10 μg/mL anti-Flt-1，PIGF 誘導(dǎo)的管腔長(zhǎng)度被砍掉 85%，背景無(wú)影響。濃度降到 5 μg/mL，抑制率只剩 40%，容易誤判為非特異性作用。

7. 讀板參數(shù)：9 點(diǎn)聚焦，Object size 50–500 μm

高內(nèi)涵成像儀 4× 物鏡，每孔 9 點(diǎn)均勻采樣，Object size 設(shè) 50–500 μm，可排除細(xì)胞碎片。閾值 Sensitivity 45、Threshold BG 15，保存模板，下次實(shí)驗(yàn)直接調(diào)用，板間 CV 從 12% 壓到 7%。