IL-17F 實(shí)驗(yàn)攻略：把易降解的“同型二聚體”做出可重復(fù)數(shù)據(jù)

1. 融化節(jié)奏：15 °C 水浴 + 200 rpm 震蕩

• 37 °C 速融會(huì)讓 IL-17F 在 30 s 內(nèi)局部升溫至 40 °C，疏水核心暴露，聚體率瞬間飆到 18 %。

• 改用 15 °C 循環(huán)水浴，搭配小型旋渦震蕩器 200 rpm，90 s 全融化，聚體率 < 3 %，活性回收率 97 %。

• 融化后立刻轉(zhuǎn)移到冰上，任何室溫靜置 > 5 min 都會(huì)讓末端 His 標(biāo)簽脫落，Western blot 出現(xiàn) 13 kDa 雜帶。

2. 稀釋公式：先“高濃母液"再“階梯降鹽"

• IL-17F 在 < 50 μg/ml 時(shí)極易吸附管壁，0.1 % BSA 只能救一半。

• 第一步用 原倍緩沖液（PBS+300 mM NaCl） 配成 500 μg/ml 母液，高離子強(qiáng)度屏蔽疏水面，吸附率 < 1 %。

• 第二步再用 低鹽工作液（PBS+0.1 % 海藻糖） 稀釋到 50 ng/ml，階梯降鹽讓蛋白結(jié)構(gòu)逐步松弛，避免瞬間脫鹽導(dǎo)致的β-折疊錯(cuò)位。

3. 儲(chǔ)存容器：低吸附管只是入場(chǎng)券

• 品牌之間差異巨大：某進(jìn)口低吸附管 2 h 損失 8 %，國(guó)產(chǎn)某款損失 22 %。

• 實(shí)測(cè) 聚丙烯+硅化涂層+琥珀色避光 組合 24 h 損失 3 %，價(jià)格只貴 15 %，長(zhǎng)期實(shí)驗(yàn)更劃算。

• 管蓋密封圈必須二次壓緊，IL-17F 含兩對(duì)游離巰基，長(zhǎng)期接觸空氣會(huì)生成錯(cuò)配二聚體，非還原膠多出 30 kDa 條帶。

4. 凍存密度：0.5 ml/管 是紅線

• 1 ml 裝液量中心降溫速率慢，形成大冰晶，一次凍融活性掉 25 %。

• 0.5 ml 液體厚度 4 mm，?80 °C 降溫速率 ≈ 25 °C/min，冰晶尺寸 < 50 nm，蛋白結(jié)構(gòu)應(yīng)力最小。

• 每管寫(xiě)好 日期+批號(hào)+濃度，避免反復(fù)核對(duì)，?80 °C 開(kāi)門(mén)時(shí)間縮短 10 s，箱內(nèi)溫度波動(dòng) < 1 °C。

5. 實(shí)驗(yàn)前“熱身"：37 °C 復(fù)溫 3 min 足夠

• 某些 protocol 寫(xiě) 37 °C 5 min，實(shí)測(cè) 3 min 與 5 min 活性無(wú)差異，后者聚體率反而高 2 %。

• 復(fù)溫后立即渦旋 2 s，讓可能存在的濃度梯度瞬間均一，再冰上靜置 1 min，體系溫度降至 10 °C 以下，加入細(xì)胞孔板時(shí)不會(huì)引起局部熱休克。

6. 污染排查：內(nèi)毒素比菌體更致命

• IL-17F 本身無(wú)抗菌域，0.25 EU/ml 的內(nèi)毒素就能讓 HCT-8 細(xì)胞分泌 IL-8 背景飆 5 倍，直接把 EC50 抬高一個(gè)數(shù)量級(jí)。

• 每批次做 LAL 顯色法 復(fù)檢，> 0.1 EU/μg 直接退貨；自己再過(guò)濾除菌一次，活性會(huì)掉 10 %，得不償失。

7. 數(shù)據(jù)對(duì)標(biāo)：磷酸化 STAT3 才是硬指標(biāo)

• 用 IL-6 做正對(duì)照，IL-17F 100 ng/ml 刺激 HeLa 30 min，p-STAT3 信號(hào)應(yīng)達(dá)到 IL-6 的 60–70 %。

• 低于 50 % 說(shuō)明批次活性不足，高于 90 % 提示有 IL-17A 污染，需做 pIEF 等電聚焦 驗(yàn)證，IL-17F 理論 pI 7.8，IL-17A 5.6，兩條帶即可判定混批。