引言

隨著生物制藥技術(shù)的迅猛發(fā)展，抗體-藥物偶聯(lián)物（ADC）作為一種高效且有針對(duì)性的藥物類型，正逐步在腫瘤治療中展現(xiàn)出其優(yōu)勢(shì)。ADC藥物的療效在很大程度上取決于其內(nèi)化效率，即抗體能否有效地被靶細(xì)胞內(nèi)化并釋放藥物。在這一背景下，DT3C重組蛋白作為評(píng)價(jià)抗體內(nèi)化效率的重要工具，正受到越來越多研究者的關(guān)注。

ADC內(nèi)化效率檢測(cè)原理

DT3C（Diphtheria Toxin Fragment A and Streptococcus Protein G C1, C2, C3）是一種重組表達(dá)的融合蛋白，由白喉毒素的Fragment A（僅毒素部分）和G群鏈球菌的3C片段（IgG結(jié)合部分）融合而成。該蛋白能夠與抗體的Fc端高度親和，與抗體結(jié)合的DT3C分子在抗體被內(nèi)吞時(shí)一同進(jìn)入細(xì)胞。DT3C可以與任何IgG型抗體結(jié)合，因此可用于檢測(cè)來自不同物種的抗體內(nèi)化效率。DT3C與抗體結(jié)合后形成的mAb-DT3C偶聯(lián)物在體外模擬ADC藥物的作用機(jī)制，有助于在藥物研發(fā)早期階段評(píng)估抗體的內(nèi)化能力和藥物的釋放效率。

(a) DT3C由催化(Cat)、轉(zhuǎn)位(T)和Fc結(jié)合(3C)結(jié)構(gòu)域組成。DT3C的Fc結(jié)合結(jié)構(gòu)域特異性地與抗體結(jié)合。

(b) mAb-DT3C偶聯(lián)復(fù)合物識(shí)別并結(jié)合細(xì)胞表面抗原后，mAb-DT3C-抗原復(fù)合物被內(nèi)化。，其中DT3C的轉(zhuǎn)位末端被細(xì)胞弗林蛋白酶切割，DT3C的催化結(jié)構(gòu)域被釋放到細(xì)胞質(zhì)中，DT3C釋放出具有毒性的DT，DT能夠抑制EF2-ADP核糖基化的活性，阻斷蛋白翻譯過程，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。

未進(jìn)入細(xì)胞的DT3C則不具有殺傷細(xì)胞的活性，因此可根據(jù)細(xì)胞殺傷情況來評(píng)價(jià)抗體的內(nèi)化效率。

檢測(cè)步驟

01 制備mAb-DT3C偶聯(lián)物

將DT3C蛋白和目的抗體在室溫下孵育30分鐘，形成mAb-DT3C共軛物。

02 共培養(yǎng)

將mAb-DT3C偶聯(lián)物直接加到含有抗原陽性細(xì)胞（如腫瘤細(xì)胞）的培養(yǎng)基中進(jìn)行孵育。

03 檢測(cè)內(nèi)化效率

通過流式細(xì)胞術(shù)或熒光顯微鏡等方法，檢測(cè)細(xì)胞活力或細(xì)胞死亡情況，從而評(píng)估抗體在細(xì)胞表面的內(nèi)化效率。

DT3C檢測(cè)ADC藥物抗體內(nèi)化效率優(yōu)勢(shì)

廣泛適用性：可與來自不同物種（如人、小鼠、兔、山羊）的任何IgG結(jié)合。

高效性：在室溫下孵育30分鐘即可形成mAb-DT3C偶聯(lián)物。DT3C在細(xì)胞內(nèi)能夠迅速釋放出具有毒性的DT，從而快速評(píng)估抗體的內(nèi)化效率。

內(nèi)化效率高：分子量小于Mab-ZAP，mAb-DT3C內(nèi)化效率高于mAb-Mab-ZAP。

便捷性：通過流式細(xì)胞術(shù)或熒光顯微鏡等方法，即可快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)mAb在細(xì)胞表面的內(nèi)化效率。

注意事項(xiàng)：在進(jìn)行體外檢測(cè)時(shí)，應(yīng)確保實(shí)驗(yàn)條件的一致性，如細(xì)胞種類、細(xì)胞濃度、DT3C和抗體的比例、孵育時(shí)間等。需要嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)過程中的無菌操作，以避免外界因素的干擾。

展望

隨著生物制藥技術(shù)的不斷發(fā)展，ADC藥物在腫瘤治療中的應(yīng)用前景日益廣闊。然而，ADC藥物的療效受多種因素影響，其中抗體的內(nèi)化效率是關(guān)鍵因素之一。因此，對(duì)抗體內(nèi)化效率的準(zhǔn)確評(píng)估對(duì)于ADC藥物的研發(fā)具有重要意義。DT3C重組蛋白作為一種高效、簡便、廣泛適用的評(píng)價(jià)工具，將在ADC藥物研發(fā)中發(fā)揮越來越重要的作用。未來，隨著DT3C技術(shù)的不斷完善和應(yīng)用領(lǐng)域的拓展，相信將為ADC藥物的研發(fā)提供更多有力的支持。

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