ELISA檢測方法原理、操作步驟及常見問題

ELISA（酶聯(lián)免疫吸附測定）是一種廣泛應用于生物醫(yī)學研究和臨床診斷的實驗技術。由于其高靈敏度和具體性，ELISA已成為檢測抗體、激素、蛋白質和病原體的方法。

一、ELISA檢測原理

基本原理

方法類型

• 直接ELISA：使用直接標記有酶的抗體對抗原進行檢測。
• 間接ELISA：使用兩種抗體，第一抗體特異地識別抗原，第二抗體識別第一抗體并標記有酶。
• 夾心ELISA：利用兩種抗體夾住抗原，其中一種固定，另一種標記有酶。
• 競爭ELISA：抗原和標記有酶的抗原競爭同一抗體的結合位。

二、實驗前的準備

實驗材料

• 抗體：選擇高特異性和親和力的抗體。
• 酶標記底物：常用的酶如辣根過氧化物酶（HRP）或堿性磷酸酶（AP），底物選擇應與酶相匹配。
• 洗滌液：通常使用含有Tween-20的PBS緩沖液以減少非特異性結合。
• 阻斷液：用于阻斷微孔板中未被抗體或抗原占據(jù)的位點，防止非特異性吸附。

設備與環(huán)境

• 酶標儀：用于讀取酶反應產(chǎn)生的光信號。
• 實驗室環(huán)境：需要保持清潔，溫度和濕度控制適中以保證實驗的準確性和重復性。

三、操作步驟詳解

1. 樣品準備

• 處理：取所需樣品體積，如有必要，進行適當稀釋以符合測試范圍。

• 存儲：將樣品分裝在避光小管中，存放于-20°C以下以避免降解。避免反復凍融，建議分裝成單次使用量。

2. 加樣與孵育

• 加樣：在微孔板中加入50 µL樣品到每個測試孔中。使用多通道移液器可以提高效率和準確性。

• 孵育：將孔板覆蓋，放置在37°C孵育器中孵育1小時，或根據(jù)抗體配套文件推薦的時間進行孵育。

3. 洗滌

• 洗滌次數(shù)：用自動洗板機或手動洗板，每次加入300 µL洗滌緩沖液，靜置幾秒后棄液，重復此過程至少3次。

• 洗滌技巧：確保每次洗滌液充分覆蓋孔底，避免泡沫產(chǎn)生，因泡沫可能導致孔間污染。

4. 酶標底物加入和信號發(fā)展

• 底物加入：向每個孔中加入100 µL酶底物（如TMB），在避光條件下室溫孵育15-30分鐘。

• 終止反應：加入50 µL的終止液（如2N硫酸），反應立即停止，并將顏色由藍變黃。

5. 讀取結果

• 使用酶標儀：在450 nm波長下讀取吸光度值。如果可能，讀取650 nm作為參考波長，以校正板材不均或泡沫的影響。

四、注意事項與經(jīng)驗分享

常見問題及對策

• 孔板交叉污染：使用新的吸頭和適當?shù)募夹g，如慢速釋放液體到孔壁，避免液體直接沖擊到孔底。

• 底物不穩(wěn)定：底物開封后應避光保存，并在推薦的有效期內使用，過期底物可能導致信號弱或背景高。

經(jīng)驗技巧

• 提高靈敏度：優(yōu)化底物的孵育時間，觀察顏色變化，避免過度孵育導致信號飽和。

• 減少非特異性背景：增加阻斷步驟的時間或使用高效的阻斷劑，如脫脂牛奶粉或BSA，以填補未被抗體或抗原占據(jù)的微孔板表面。